一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用，所述制备方法包括以下步骤：A、扩增RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；C、将步骤B得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；D、将步骤C得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。本发明专利技术成功构建了表达兔病毒性出血症Ⅱ型衣壳蛋白的杆状病毒，并使其在昆虫细胞上成功表达，最终通过蛋白电泳，免疫印迹、电镜观察进行了病毒表达产物的鉴定。该杆状病毒在未来可以用来进行新型兔病毒性出血症亚单位疫苗的研究，以此用来预防兔病毒性出血症Ⅱ型。

Preparation and application of a baculovirus type II capsid protein expressing rabbit hemorrhagic disease virus

The invention provides a preparation and application of a rabbit viral hyponatremia virus type II capsid protein baculovirus. The preparation method includes the following steps: A, amplification of the VP60 gene of RHDV2; B, cloning of the VP60 gene from step A in the insect baculovirus expression vector, and obtaining the plasmid; C, the plasmid obtained by step B. The recombinant plasmids were transformed into recombinant plasmids, and D, the recombinant plasmid obtained by step C transfected into insect cells mediated by liposome, that is, the rabbit viral hyponatremia virus II capsid protein baculovirus was obtained. The invention successfully constructed baculovirus expressing rabbit viral hyponatremia type II capsid protein, and successfully expressed it on insect cells. Finally, the virus expression products were identified by protein electrophoresis, immunoblotting and electron microscopy. The baculovirus can be used in the future for the study of new subunit vaccine of rabbit viral hemorrhagic disease to prevent rabbit viral hemorrhagic disease type II.

【技术实现步骤摘要】
一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用。
技术介绍
兔病毒性出血症病毒Ⅱ型(RHDV2)又称为新型兔瘟，是一种新发的、目前已广泛流行于欧洲、澳大利亚的动物传染病。该病毒可引起免疫过经典兔瘟疫苗的兔患病，同时还能感染野兔，致病率高，并且该病毒能够感染经典兔病毒性出血症病毒不能感染的小于四十日龄的幼龄家兔，其引起的主要临床症状包括急性肝坏死，气管出血，肺脏出血，肝脏出血以及坏死等，同时临床中多伴有脾脏肾脏肿大。目前该病毒在澳大利亚已经有取代经典兔瘟的趋势，而在欧洲该病毒也严重影响了养兔业发展，严重危害着野生动物的安全。在已爆发新型兔瘟的国家，例如荷兰，法国、意大利、波兰等，其仍采用经典的灭活疫苗法来防治新型兔瘟，但是传统的灭活疫苗其在灭活过程中有可能损害或改变有效的抗原决定簇，产生的免疫效果以及维持时间相对较短，而且需要多次注射灭活疫苗，对抗原量的需求比较大，成本相对而言也比较高；也可能产生毒性或存在潜在的对机体不利的免疫反应，与此同时灭活苗在一定程度上也存在散播强毒的潜在危险，最重要的是在灭活疫苗的制备过程中也必须使用RHDV2感染致死的兔内脏组织为原料，而如今在国内尚未有关于新型兔瘟病毒的报道，其是否由于检测手段的不完善性导致的也不得而知。RHDV2的衣壳蛋白是RHDV2的主要结构蛋白，由该病毒的VP60基因编码，该蛋白并且能够自我组装成为病毒样颗粒，病毒样颗粒不含有病毒的核酸，可以模拟病原刺激机体产生免疫保护效应，而且利用杆状病毒表达系统表达的衣壳蛋白，具有翻译后修饰功能，使得重组的蛋白在结构和功能上与天然蛋白更接近。目前利用杆状病毒表达系统生产制备的疫苗已广泛使用于各类疾病的预防，例如乙型肝炎和人乳头瘤病毒等等。鉴于RHDV2可能对我国养兔业带来巨大的经济损失，制备该病毒的亚单位疫苗以及日后研究该病毒的检测方法对于我国养兔业具有重要的意义，也为我们未来继续研究RHDV如何演化成为RHDV2提供一定的研究基础。而目前尚未有采用杆状病毒表达RHDV2衣壳蛋白的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用。本专利技术参照NCBI公布的兔病毒性出血症病毒Ⅱ型RHDV2的衣壳蛋白(VP60)编码基因开放阅读框，设计了一对含有特异性酶切位点的引物，扩增RHDV2的衣壳蛋白编码基因，将扩增的基因克隆于昆虫杆状病毒表达载PFAST-BAC-HTA中。本专利技术涉及兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白基因重组杆状病毒的制备研究，通过扩增兔病毒性出血症病毒Ⅱ型的衣壳蛋白VP60全长片段，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获得能够表达衣壳蛋白的杆状病毒，然后将该病毒的表达产物通过相关技术手段进行了鉴定，本专利技术提供了一种可以成功表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白的方法，表达的衣壳蛋白可以自我包装成病毒样颗粒(viruslikeparticles)，在未来可以用来进行新型兔病毒性出血症亚单位疫苗的研究，以此用来预防兔病毒性出血症Ⅱ型。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：A、扩增RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；C、将步骤B得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；D、将步骤C得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。优选地，步骤A中，扩增RHDV2的VP60基因采用的引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。优选地，所述引物的酶切位点分别为GAATTC和TCTAGA。优选地，所述昆虫杆状病毒表达载体为PFASTBAC-HTA；所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞；所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞；所述脂质体为Cellfectin脂质体。本专利技术采用的昆虫杆状病毒表达载体PFASTBAC-HTA含有His标签，利于后期的纯化；采用的Sf9昆虫细胞是无血清培养，有利于后期大规模悬浮培养；采用Cellfectin脂质体可获得更高的转染效率，若采用其他脂质体，则转化效率不高，不利于获得重组杆状病毒。本专利技术还提供了一种根据前述方法制备的表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。本专利技术还提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的表达产物鉴定方法，包括以下步骤：将所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒感染昆虫细胞后进行培养，取培养的病毒上清液，通过Western-blot以及IFA方法对病毒表达的特征蛋白进行鉴定。优选地，所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒与昆虫细胞的比例为1:10～1:100。优选地，所述培养条件为：28℃培养96h～120h。本专利技术还提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的应用，所述应用包括：采用所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒制备兔病毒性出血症Ⅱ型亚单位疫苗，或制备RHDV2酶联免疫吸附试剂中的应用。本专利技术所述的杆状病毒表达的产物与抗His蛋白的单克隆抗体存在免疫学反应。同时因为利用的该杆状病毒载体表达水平高，且含有His标签，可以方便后期的纯化步骤，可以制备成兔病毒性出血症Ⅱ型亚单位疫苗，也可以作为日后建立RHDV2酶联免疫吸附试剂制备研发中的包被用抗原。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术基于昆虫杆状病毒表达系统优于原核表达系统的优点—表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力，开展了RHDV衣壳蛋白在昆虫细胞上的表达。在表达RHDV2蛋白的过程中，通过免疫印迹、间接免疫荧光等方法表明实验获得了具有生物活性的RHDV2-VP60蛋白，并准确地鉴定了表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。并通过电镜观察发现表达的该病毒蛋白可以组装成为病毒样颗粒(viruslikeparticles)。目前，基于杆状病毒表达系统生产的疫苗已广泛使用，因为杆状病毒只能感染非脊椎动物，且其感染的宿主昆虫细胞也不能在外界寄生，因此，利用该表达系统表达的VP60蛋白具有较高的生产实践意义。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1RHDV2-VP60的PCR扩增图；其中：M为DNA标准Trans2KplusII；1为RHDV2-VP60F/R扩增片段；2为阴性对照；图2重组质粒PFAST-RHDV2-VP60的酶切鉴定图；其中：M为DNA标准markerTrans2KplusII；1-3为PFastHTA-RHDV2-VP60经EcoRI和XbaI双酶切的平行试验；图3重组质粒Bacmid-RHDV2-VP60的PCR扩增图；其中M：DNA标准markerTrans2KplusII；1-12：Bacmid-RHDV2-VP60F/R扩增片段的平行试验；图4重组质粒Bacmid-RHDV2-VP60的PCR鉴定；其中M：DNA标准markerTrans2KplusII；1-5：Bacmid-RHD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、扩增RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；C、将步骤B得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；D、将步骤C得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。

【技术特征摘要】
1.一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、扩增RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；C、将步骤B得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；D、将步骤C得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。2.根据权利要求1所述的表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤A中，扩增RHDV2的VP60基因采用的引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。3.根据权利要求2所述的表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，其特征在于，所述引物的酶切位点分别为GAATTC和TCTAGA。4.一种根据权利要求1所述方法制备的表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。5.一种表达兔病毒性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光清，缪秋红，朱杰，唐井玉，殷冬冬，李传峰，陈宗艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海,31