顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统技术方案

本发明专利技术提供了一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)毒株H129衍生的(H129‑derived)顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统；所述示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescence expression cassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列(fluorescent protein‑encoding sequence)，所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及神经生物学，并且更具体地涉及顺行(anterograde)跨多级突触、跨神经元的(multi-synaptictransneuronal)病毒示踪系统。
技术介绍
绘制大脑连接组对了解大脑是如何工作来说是必不可少的。作为神经功能的基本单位，神经环路在宏观结构/功能和微分子/信号环路间起到桥梁的作用。然而，许多特定的功能神经环路的结构，包括组件，联接和分布，仍有待阐明。新的示踪技术和示踪工具，特别是病毒示踪工具，有助于发现新的环路和揭示已知的经典环路的新联结和功能。病毒示踪工具已经用于神经科学研究。狂犬病病毒(RV)和伪狂犬病病毒(PRV)的衍生病毒示踪工具可以逆行追踪神经环路从而标记输入神经网络(1)。重组水泡口炎病毒(VSV)用于顺行或逆行跨突触环路示踪(2，3)。人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129(H129)是一个潜在的顺行跨突触神经环路的示踪工具(4,5)。然而，高效和高分辨率地绘制顺行输出神经环路的细节仍然是一个挑战。因此，开发具有高跨突触标记效率的顺行示踪工具是迫切需要的。
技术实现思路
本专利技术提供了一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129衍生的(H129-derived)顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统。在一个实施例中，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescenceexpressioncassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列(fluorescentprotein-encodingsequence),所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光表达盒包括一个启动子；所述启动子调节所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列的转录。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述启动子在神经元细胞中可操作，包括CMV启动子，SV40启动子，CAG启动子，EF1a启动子，TH启动子，Syn1启动子.在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述在一个表达盒中的荧光蛋白编码序列编码相同的或不同的荧光蛋白。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO2)代表的荧光蛋白，或其变体。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO4)代表的膜结合绿色荧光蛋白(mGFP)，或其变体。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述连接子多肽含有的至少两个相邻氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述连接子编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO6)代表的多肽或其变体。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列编码一个氨基酸序列(SEQIDNO8)或其变体。在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中，进一步含有BAC序列。通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本专利技术的目的和优点是显而易见的。附图说明本专利技术的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。图1所示的结构示意图(a)H129-wt基因组的结构示意图，(b)H129-G1基因组结构示意图，(c)H129-G3基因组结构示意图，(d)H129-G4基因组结构示意图，(e)构建pUS-F6，和(f)构建H129-BAC(即H129-G1)。图2所示：(a)H129-G1单克隆的PCR验证结果；(b)伴随病毒复制的GFP表达和细胞病变；(c)通过Westernblot显示病毒蛋白；(d)H129-wt和H129-G1生长曲线；(e)H129-wt、H129-G1、H129-G3和H129-G4在VERO细胞中的生长曲线。图3所示(a)图像和(b)H129-G1、H129-G3和H129-G4体外荧光强度。图4显示微流控系统的结构示意图。图5显示H129-G4在培养的神经元中的顺行传播；(a-b)H129-G4的胞体进入和顺行标记；(c-d)H129-G4顺行跨神经突触标记。图6显示用H129-G3示踪VPM-S1环路图7显示使用H129-G4绘制M1区输出的信号。图8显示使用H129-G4绘制树鼩中M1区输出的信号。图9显示使用H129-G4示踪视觉环路。图10显示使用H129-G4示踪嗅觉环路。具体实施方式可以通过引用以下的本专利技术的某些实施例的详细描述而更容易地理解本专利技术。在本申请中，为了更充分地描述本专利技术所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。除非另有说明，在本专利技术的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；分子生物学当代程序(FMAusubel等主编，1987年，包括补充至2001年)。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是一种普遍存在的、条件致病病原。其自然神经嗜性和跨神经突触的传播能力使其成为潜在的神经环路示踪工具。HSV-1毒株McIntyre-B逆行传播，而HSV-1毒株H129优先顺行跨神经突触传播[6-8]。许多研究在不同的途径和不同的动物模型中的应用了这种病毒[6,9-12]。特别是，表达遗传改变的荧光蛋白(FP)的H129的研发促使了探索该病毒株在顺行神经环路中的示踪[3,13]。然而，由于有限的标记强度，这些H129衍生的示踪工具无法让突触环路可视化，也无法显示神经元形态的细节[5,14]本专利技术提供H129衍生的(H129-derived)顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统，用于绘制跨多级突触、跨神经元的环路，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统标记强度高，足以让精细神经结构可视化，包括神经元轴突纤维和树突棘，同时与荧光显微光学切片成像(fMOST)兼容。简而言之，H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescenceexpressioncassette)，插入到H129基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)毒株H129衍生(H129‑derived)的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescence expression cassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列(fluorescent protein‑encoding sequence)，所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。

【技术特征摘要】
1.重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129衍生(H129-derived)的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129，包括两个或两个以上的荧光表达盒(fluorescenceexpressioncassette)，插入到H129基因组的不同位点，其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列(fluorescentprotein-encodingsequence)，所述荧光蛋白编码序列前后排列，和至少一个连接子编码序列，两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子；所述连接子编码序列编码一个连接子多肽；所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸，他们间的肽键形成是非常低效的；因此，所述转录子被翻译时，由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成，能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。2.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述荧光表达盒包括一个启动子；所述启动子调节所述荧光蛋白编码序列和连接子序列的转录。3.根据权利要求2所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统，其特征在于，所述启动子在神经元细胞中可操作，包括CMV启动子,SV40启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏华，曾文波，江海飞，赵非，杨虹，宋一舸，谌章舟，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42