一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，包括将启动子插入pXC2‑Δ24中并连接到质粒中，酶切；将TSLC1基因与质粒连接，将连接产物与DH5α感受态细胞混合，酶切；将上述两个步骤得到的终产物连接，转化到含有全序列腺病毒骨架的质粒大肠杆菌中重组，产生E1A区由启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A‑CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒；腺病毒骨架DNA质粒用pacⅠ酶切线性转化后，转染到293A细胞中病毒包装，病变后，得到溶瘤腺病毒Ad.wnt‑E1A(Δ24)‑TSLC1。采用本发明专利技术的构建方法得到的溶瘤腺病毒对结肠癌细胞和肝癌细胞具有明显的杀伤效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，尤其涉及一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法。
技术介绍
癌症是当前危害全世界人类健康的最主要原因之一，即使近年来在手术治疗、化疗和放疗取得了进步，但也无法阻止肿瘤的死亡率和发病率上升的趋势。根据世界卫生组织的统计数据显示，在2000年，癌症新增1000万病例，死于癌症的患者有600万；在2002年，癌症新增1090万病例，死于癌症的患者有670万；在2008年，癌症新增1270万病例，死于癌症的患者有760万；在2012年，癌症新增1410万病例，死于癌症的患者有820万，这显示了肿瘤的死亡率和发病率呈上升趋势。因此，解决癌症这一难题一直是研究肿瘤的科学家和临床医生所追求的最大理想。由于肿瘤的发生是很复杂的过程，因此一直找不到很好的方法去抑制肿瘤，基因治疗的出现为治疗肿瘤提供新的想法，于是，在上世纪八十年代提出了肿瘤的基因治疗。肿瘤的基因治疗需要一个对肿瘤具有杀伤性的基因和一个具有较高安全性的载体，而这两个因素是关键。但事实上，经研究发现，即使肿瘤的基因治疗安全性较高，但其杀伤肿瘤的效果很差，结果与所期望的目标相差很远。为了解决上述问题，现有技术发展了一种肿瘤的病毒疗法，病毒具有自主复制能力和感染性，通过基因工程对病毒进行改造，使病毒具有对肿瘤细胞靶向性，但不感染正常细胞，通过病毒自主复制后能裂解细胞的能力来消灭肿瘤细胞。虽然与基因药物相比，病毒对肿瘤的抑制效果更好，但是依靠单独的腺病毒对肿瘤的杀伤力还没有达到所预期的效果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，使构建的溶瘤腺病毒对肿瘤具有抑制作用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：1)将TCF/LEF启动子插入pXC2-Δ24中，再连接到pshuttle中，构建成pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)，经KpnⅠ酶切后得到线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)；2)从质粒pcDNA3-hygro上获得TSLC1基因，将得到的TSLC1基因与pMD18-T-Vector连接，得到TSLC1连接产物，将所述TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞混合，得到重组质粒T-TSLC1，所述重组质粒T-TSLC1经KpnⅠ酶切后，得到TSLC1片段；3)将所述步骤1)得到的线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)与所述步骤2)得到的TSLC1片段经连接酶连接后，得到pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1；4)将所述步骤3)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1经PmeⅠ线性化转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由TCF/LEF启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A-CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒；5)将所述步骤4)得到的腺病毒骨架DNA质粒用pacⅠ酶切线性转化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(Δ24)-TSLC1；所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。优选的，所述步骤1)中需要对pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)进行鉴定，所述pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)鉴定的PCR体系为：所述步骤1)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)1μl、TSLC1sence引物2μl、TSLC1antisence引物2μl、10×Buffer5μl、MgSO44μl、dNTP1μl、KOD酶1μl和ddH2O35μl。优选的，所述步骤1)中需要对pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)进行鉴定，所述pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)鉴定的PCR程序为：94℃预变性10min，98℃变性45s，60℃退火1min，68℃延伸1min，30～35个循环，68℃终延伸10min。优选的，所述步骤2)中从质粒pcDNA3-hygro上获得TSLC1基因需要进行PCR扩增，所述PCR扩增体系为：pcDNA3-hygro1μl、TSLC1sence引物2μl、TSLC1antisence引物2μl、10×Buffer5μl、MgSO44μl、dNTP1μl、KOD酶1μl和ddH2O35μl。优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性10min，94℃预变性1min，55℃退火1min，68℃延伸1min，30～35个循环，4℃保存。优选的，所述步骤2)中TSLC1基因与pMD18-T-Vector连接的反应体系为：pMD18-T-Vector1μl、TSLC1基因1μl、LigationMix5μl和ddH2O3μl。优选的，所述步骤2)中的TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞的体积比为(5～15):(190～210)。优选的，所述步骤2)中的重组质粒经KpnⅠ酶切的反应体系为：pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)8μl、KpnⅠ1μl、10×TangoBuffer2μl和ddH2O9μl。优选的，所述步骤3)中线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)与TSLC1片段进行酶连接的体系为：线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)2.5μl、TSLC1片段7.5μl和Ligationhigh2.0ver10μl。本专利技术提供了一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：1)将TCF/LEF启动子插入pXC2-Δ24中，再连接到pshuttle中，构建成pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)，经KpnⅠ酶切后得到线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)；2)从质粒pcDNA3-hygro上获得TSLC1基因，将得到的TSLC1基因与pMD18-T-Vector连接，得到TSLC1连接产物，将所述TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞混合，得到重组质粒T-TSLC1，所述重组质粒T-TSLC1经KpnⅠ酶切后，得到TSLC1片段；3)将所述步骤1)得到的线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)与所述步骤2)得到的TSLC1片段经连接酶连接后，得到pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1；4)将所述步骤3)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1经PmeⅠ线性化转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由TCF/LEF启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A-CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒；5)将所述步骤4)得到的腺病毒骨架DNA质粒用pacⅠ酶切线性转化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(Δ24)-TSLC1；所述步骤1)和步骤2)没有时间顺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：1)将TCF/LEF启动子插入pXC2‑Δ24中，再连接到pshuttle中，构建成pshuttle‑TCF/LEF‑E1A(Δ24)，经Kpn Ⅰ酶切后得到线性化处理的pshuttle‑TCF/LEF‑E1A(Δ24)；2)从质粒pcDNA3‑hygro上获得TSLC1基因，将得到的TSLC1基因与pMD18‑T‑Vector连接，得到TSLC1连接产物，将所述TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞混合，得到重组质粒T‑TSLC1，所述重组质粒T‑TSLC1经Kpn Ⅰ酶切后，得到TSLC1片段；3)将所述步骤1)得到的线性化处理的pshuttle‑TCF/LEF‑E1A(Δ24)与所述步骤2)得到的TSLC1片段经连接酶连接后，得到pshuttle‑TCF/LEF‑E1A(Δ24)‑TSLC1；4)将所述步骤3)得到的pshuttle‑TCF/LEF‑E1A(Δ24)‑TSLC1经Pme Ⅰ线性化转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy‑1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由TCF/LEF启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A‑CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒；5)将所述步骤4)得到的腺病毒骨架DNA质粒用pac Ⅰ酶切线性转化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒Ad.wnt‑E1A(Δ24)‑TSLC1；所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。...

【技术特征摘要】
1.一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：1)将TCF/LEF启动子插入pXC2-Δ24中，再连接到pshuttle中，构建成pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)，经KpnⅠ酶切后得到线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)；2)从质粒pcDNA3-hygro上获得TSLC1基因，将得到的TSLC1基因与pMD18-T-Vector连接，得到TSLC1连接产物，将所述TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞混合，得到重组质粒T-TSLC1，所述重组质粒T-TSLC1经KpnⅠ酶切后，得到TSLC1片段；3)将所述步骤1)得到的线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)与所述步骤2)得到的TSLC1片段经连接酶连接后，得到pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1；4)将所述步骤3)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1经PmeⅠ线性化转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由TCF/LEF启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A-CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒；5)将所述步骤4)得到的腺病毒骨架DNA质粒用pacⅠ酶切线性转化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(Δ24)-TSLC1；所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。2.根据权利要求1所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中需要对pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)进行鉴定，所述pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)鉴定的PCR体系为：所述步骤1)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)1μl、TSLC1sence引物2μl、TSLC1antisence引物2μl、10×Buffer5μl、MgSO44μl、dNTP1μl、KOD酶1μl和ddH2O35μl。3.根据权利要求2所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中需要对p...

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅刚，章健，金槿，马步云，李强，来维洁，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33