鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂预防/治疗药物中的应用。本发明专利技术所述药物为由鸦胆子苦素D为活性成分与药用辅料组成的药物组合物，为口服制剂、注射剂或皮肤给药制剂。用人肝癌肿瘤细胞系和人正常肝细胞系模型评估鸦胆子苦素D体外抗肿瘤功效；用斑马鱼模型评价化合物鸦胆子苦素D对Wnt/Notch信号通路的抑制作用，实验结果100μM鸦胆子苦素D在不引起斑马鱼死亡的条件下，观察到Wnt信号通路抑制后所引起的体轴发育异常。通过鸦胆子苦素D的体内外抗肿瘤活性研究实验，首次公开鸦胆子苦素D对Wnt/Notch信号通路中关键蛋白的影响，验证了Wnt/Notch信号通路在肝癌中的重要作用以及Wnt/Notch信号通路的内在关系，提供鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物的新用途，为临床提供预防/治疗肝癌药物，有很大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及中药，具体涉及中药提取物单体鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，尤其涉及中药提取物单体鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物中的应用。
技术介绍
肝癌既包括肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(CC)，是世界第五大癌症，每年,大约有750000例被诊断,而700000人死于肝癌，使其成为全球死亡率第三大癌症，严重影响着人们的健康。近年来，在肝癌的诊断及治疗方面虽然取得一些进展，但晚期肝癌存活率仍较低。肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC),是原发性肝癌的最主要类型。肝细胞癌的主要特点为侵袭性强，易转移，其发生，并且其发生发展是一个多基因参与、多步骤、多阶段的过程。目前，针对肝细胞癌的治疗方法主要分为手术治疗和非手术治疗，由于肝切除术可根治肝细胞癌，提高患者生存率，是公认的最有效的治疗肝细胞癌的手段之一，然而仍然存在其局限性：肿瘤细胞增殖快，恶性程度高，极易发生散播和转移；多数肿瘤为多中心发生，很难彻底根除；肝细胞癌患者大部分具有肝硬化基础，导致肝功能代偿无法实施手术。因此，联合应用手术治疗与各种非手术治疗成为治疗肝细胞癌的优先选择。肝癌的发生发展涉及到多种信号转导通路共同参与完成，如Notch信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路，TLR4/NF-kB信号通路，Ras、Jnk信号通路，mTOR通路等，近年来Wnt/Notch信号通路成为肝细胞癌发病机制的研究热点而倍受关注。鸦胆子也叫老鸦胆或苦参子。系苦木科植物Bruceajavanica(L)Merr的干燥成熟果实。性苦寒，归大肠，肝经。始载于《本草纲目拾遗》。鸦胆子是中国常用中药，具有清热解毒、截疟、止痢的功效。治疗热性赤痢或便血、疟疾、鸡眼等。在我国的南方沿海热带地区发现有鸦胆子生长。此外，亚热带地区和云南等地区也有鸦胆子分布。鸦胆子主要产于中国南方沿海热带、亚热带地区及云南等地。鸦胆子的主要活性成分----苦木内酯化合物具有抗疟、抗病毒、抗炎及抗肿瘤活性。四环三萜类内酯-苦木内酯类化合物最早是由J.Polansky于1967年从该属植物中分离的，后续不断有研究人员陆续从该属植物中发现新的抗肿瘤活性的苦木内酯类化合物。19世纪70年代。鸦胆子就开始用于治疗各种恶性肿瘤。对鸦胆子油乳抗肿瘤机制研究发现，鸦胆子油乳对肿瘤细胞的细胞形态、周期、免疫功能及多药耐药方面均有影响。该药现已成为当代治疗肿瘤最活跃的中药制剂之一。对肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、大肠癌、白血病、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、膀胱癌等多种肿瘤具有良好的疗效。鸦胆子(Bruceajavanica)中含有一类特征性的化合物，苦木素类(四环三萜苦木内酯、苦木内酯)化合物，也是鸦胆子中主要的抗癌活性成分，目前从鸦胆子水提取物中已经分离得到30多种苦木素类化合物。主要包括苦木素A-I和鸦胆子苷A-P。也有其它成分如鸦胆子苦内酯A-D，鸦胆子苦醇，鸭胆丁等等。另外从鸦胆子中还可以提取到油酸，亚油酸，硬脂酸和棕榈酸等脂溶性成分。鸦胆子中含量较高的苦木素类化合物包括：鸦胆苦醇(Brusatol)，鸦胆子苦素D(BruceineD)，鸦胆子苦素E(BruceineE)，鸦胆子苦素H(BruceineH)，鸦胆子苷A(YadanziosideA)，鸦胆子苷B(YadanziosideB)。其中对鸦胆子苦素D的抗肿瘤机制研究的较为深入，2008年由Lauetal课题组发现鸦胆子苦素D具有显著的抗胰腺癌增殖和促凋亡的作用(Lau,S.T.,etal.,Bruceajavanicafruitinducescytotoxicityandapoptosisinpancreaticadenocarcinomacelllines.PhytotherRes,2008.22(4):p.477-86.)。Wnt/Notch信号通路与肿瘤的发生，发展密切相关，在肝细胞癌中也具有重要的作用。目前关于通路通路的抑制剂普遍局限于γ-分泌酶抑制剂上，关于鸦胆子苦素D的抗肿瘤活性报道较多，对多种肿瘤具有抑制作用，但其作用机制仍不十分明确，并且未见有Wnt/Notch信号通路抑制活性的报道。本专利技术人以293T作为工具细胞用报告基因的方法筛选到Wnt/Notch信号通路抑制剂的活性化合物，从活性化合物中选择鸦胆子苦素D(BD)作为研究对象，考察鸦胆子苦素D体外抗肿瘤活性，鸦胆子苦素D对Wnt/Notch信号通路中关键蛋白的影响。Wnt/Notch信号通路之间有着复杂的相互联系，验证了通路在癌中的重要作用的同时也阐述了Wnt/Notch信号通路之间的内在关系，宜进一步开发鸦胆子苦素D新的治疗用途。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，克服上述不足之处，研究设计鸦胆子苦素D(BD)用以制备药物的用途。本专利技术提供了鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用。本专利技术提供了鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物中的应用。鸦胆子苦素D(BD)的化学结构式如下：本专利技术人利用人肝癌肿瘤细胞系和人正常肝细胞系模型评估鸦胆子苦素D体外抗肿瘤功效。将两种肝癌肿瘤细胞和两种人正常肝细胞给予不同浓度的鸦胆子苦素D(0-20μM)处理48h,并通过CCK-8检测其对细胞生长的抑制活力。结果显示，鸦胆子苦素D可以显著抑制人肝癌细胞的生长能力，其半数抑制浓度为1.87μM(图1)。而对正常肝细胞的细胞毒性较小，说明鸦胆子苦素D对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。相同浓度下不同时间点鸦胆子苦素D抑制Hep3B细胞增殖的效率不同(图1)。另外，软琼脂克隆形成结果表明，经(0.25-1μM)鸦胆子苦素D处理24h后的肝细胞癌细胞与对照组比较克隆形成能力明显降低(图1)。利用蛋白免疫印迹的方法和RT-PCR方法发现鸦胆子苦素D可以抑制Notch信号通路关键蛋白的表达，尤其对最上游关键配体Jagged1在基因和蛋白水平的表达抑制作用显著。Notch信号通路与细胞的增殖凋亡密切相关，用鸦胆子苦素D处理Huh7和Hep3B细胞系后发现周期素D1(cyclinD1),生存素(survivin)和凋亡相关蛋白PARP,caspase3显著下调。此外用三种方法验证了鸦胆子苦素D对Notch信号通路中关键酶γ-分泌酶活性的没有影响：对γ-分泌酶亚基表达量没有影响；对转染了γ-分泌酶的直接底物Notch1NEXT的293T细胞,鸦胆子苦素D对Notch1NEXT的产物NICD(NOTCH细胞内片段)表达量没有影响，而γ-分泌酶阳性抑制剂DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)确可显著抑制内源性NICD(NOTCH细胞内片段)的产生；另外鸦胆子苦素D对Hela细胞转染的人源γ-分泌酶底物N100的变化没有影响。肝癌细胞系转染Jagged1质粒后可抵抗鸦胆子苦素D对其促凋亡抗增殖作用，同时肝癌细胞系转染shJagged1质粒后也可显著促进肝癌细胞的凋亡并抑制其增殖，以上结果说明了鸦胆子苦素D是通过抑制Notch信号通路中上游Jagged1的表达而抑制了肝癌细胞的增殖，同时也说明了Jagged1在肝癌细胞增殖过程中的重要作用。本专利技术人还本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，其特征在于，所述鸦胆子苦素D为下列结构式的化合物：

【技术特征摘要】
1.鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，其特征在于，所述鸦胆子苦素D为下列结构式的化合物：2.根据权利要求1所述鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，其特征在于，所述应用为鸦胆子苦素D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫东，单磊，李明花，李昆，游蓉丽，李建伟，梁波，
申请(专利权)人：山西振东先导生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14