鸭肠炎病毒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及DEV及其用途。本发明专利技术特别适合于针对禽病原体接种家禽。

Duck enteritis virus and its use

The invention relates to DEV and its use. The invention is especially suitable for vaccinated poultry against avian pathogens.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鸭肠炎病毒及其用途专利
本专利技术涉及新病毒及其用途。更具体地，本专利技术涉及新的鸭肠炎病毒构建体及其表达或递送目的多肽至动物、特别是家禽的用途。本专利技术特别适合于接种家禽以对抗禽病原体。专利技术背景家禽肉和蛋是重要的食物来源，其消耗由于人群增长和它们极大的品质-价格比率而持续增加。最近的禽流感流行病将舆论聚焦于家禽健康以及食品安全和保障，并且家禽疫苗技术已成为全球性的关注。表达病原体蛋白的重组病毒通常用作针对靶向的病原体的家禽疫苗。包括这样的病毒的疫苗在感染的细胞内诱导外源病原体蛋白或其片段的表达，其可随后诱导特异性和保护性体液免疫以及细胞介导的免疫。在此方面，已开发其中已整合了源自病原体的外源基因的许多病毒，用作病毒载体的疫苗。这些病毒载体(或重组病毒)通常基于禽痘病毒例如禽痘(EP-A-0,517,292)、疱疹病毒，特别是HVT(例如，WO-A-87/04463、5,980,906、5,853,733)、新城疫病毒(NDV)或禽腺病毒。这些重组禽病毒显示可变水平的保护作用，取决于疾病和/或动物。例如，因为痘病毒、NDV和腺病毒在鸡中不持续存在，它们不被视为在鸡中持续时间长的免疫的最佳候选物。重组HVT表达的抗原已显示益处，并且目前被商业化用于在鸡中接种(例如，IBD、ND或LT)。然而，考虑到日益增加的病原体数量和多样性，和家禽消耗的持续增长，对可用于在家禽中引起有效的保护性免疫的备选接种策略和/或系统存在需要。特别地，对在非常幼小的动物(3天或更小)或在胚蛋中获得免疫的有效系统存在需要。在此方面，已经探索了新的病毒血清型，目的是发现备选的相容性病毒载体以改进在动物中、特别是在家禽中的接种，允许稳定的蛋白表达和有效的保护作用。WO2014/0036735论述了鸭肠炎病毒在鸡中的可能用途。DEV天然感染鸭或鹅，但对鸡没有已知的向性。该文献提示，DEV构建体可通过肌内注射给予1周龄的鸡。然而在此文献中，仅报道了晚期给予。然而通过用DEV进行进一步的实验，专利技术人发现，当给予幼小的鸡(3天或更小)或在胚蛋中给予时，这样的病毒是致死的。令人惊讶地，尽管在孵化后1周向鸡给予野生型DEV(或含有所有天然基因的DEV构建体，如WO2014/0036735中所提议的)显示耐受良好，但在孵化后第1天或在胚蛋中给予这样的构建体导致极大量的动物死亡(即，80-100％)。甚至更令人惊讶地，专利技术人已能够修饰DEV的结构以产生DEV构建体，所述构建体可用于家禽，包括非常早期阶段(3天或更小)或在胚蛋中，和可导致在体内实质的和早期阶段的蛋白表达。这样的病毒因此代表了用于接种家禽的新的有效载体。专利技术简述本专利技术提供了适合于在动物、特别是家禽中，包括非常早期阶段(即，在孵化后第3天或更早，以及在胚蛋中)体内表达基因或蛋白的新的病毒构建体。特别地，本专利技术提供了通过UL4基因失活获得的新的DEV，和证实了这样的DEV(i)在体内、特别是在鸡中是减毒的，和(ii)是稳定的并能够以适合于诱导保护性免疫的方式表达外源基因。因为这样的DEV对例如鸡没有已知的自然向性，使用这样的DEV构建体以接种鸡对未接种的动物不涉及传播或污染的风险。此外，鸡没有抗DEV的母体抗体或免疫力，并且本专利技术的病毒可用于在接种的动物中诱导非常早期的免疫启动。令人惊讶地，如之前所示的，尽管野生型DEV在幼小的鸡中或在胚蛋中是致死的，但本专利技术的DEV是安全的，并可在体内有效地表达目的基因。这样的新的DEV因此代表了用于接种非人动物、特别是家禽和用于赋予早期保护性免疫的非常有效的载体。本专利技术的目标更特别地涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因。本专利技术事实上显示，通过使UL4基因失活，可获得有活力的、稳定的和可复制的DEV，并且这样的病毒可用于通过插入外源遗传物质来产生重组DEV。结果进一步显示，这样的外源遗传物质在细胞感染时从所述病毒高表达，并且这样的表达随时间保持稳定。此外和显著地，尽管已发现天然DEV以及由专利技术人产生的许多其它缺失的DEV构建体在幼小的鸡(孵化后第3天或更早)中和在胚蛋中是致病性的或致死的，但UL4的失活产生减毒的病毒，其可安全地用于在幼小的动物中包括在胚蛋中表达蛋白和抗原。这样的发现完全是令人惊讶的，并为本专利技术的病毒提供了高度的优势和功用。本专利技术的另一个目标因此涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和包含外源核酸。根据具体的实施方案，UL4基因是突变的，或缺失的，或间断的；和/或外源核酸位于UL4基因中，其置换了所有或部分的UL4基因序列，和/或外源核酸编码禽病原体。本专利技术的另一个目标是核酸分子，其包含具有失活的UL4基因的DEV的基因组。本专利技术进一步涉及宿主细胞，其包含如上文定义的DEV或核酸。本专利技术还提供了用于生产或复制如上文定义的DEV的方法，包括用如上文定义的核酸分子或DEV感染感受态细胞，和收集DEV。本专利技术还涉及用于制备重组DEV的方法，包括将外源核酸插入DEV的UL4基因序列，优选地置换了所有或至少20％的UL4基因序列。本专利技术还提供了组合物，其包含如上文定义的DEV、核酸或宿主细胞，药学或兽医学可接受的赋形剂或载体，和任选地，佐剂。本专利技术还提供了疫苗，其包含如上文定义的DEV、核酸或宿主细胞，药学或兽医学可接受的赋形剂或载体，和任选地，佐剂。本专利技术的另一个目标涉及如上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，用于接种或免疫禽、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)。本专利技术的另一个目标涉及如上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，用于在禽、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽中(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)诱导保护性免疫。本专利技术还涉及接种非人动物、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)的方法，包括向所述非人动物给予如上文定义的组合物或病毒。本专利技术的特定目标是接种家禽的方法，包括在胚蛋中给予如上文定义的组合物或病毒。本专利技术的另一个特定目标是接种家禽的方法，包括在孵化后第1天(即，在约24小时内)给予如上文定义的组合物或病毒。在另一方面，本专利技术提供了用于在非人动物中针对一种或多种禽病原体诱导免疫原性或保护性反应的方法，包括向所述非人动物、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在蛋中)给予如上文定义的组合物、疫苗或病毒。本专利技术的病毒或组合物可通过任何途径给予。优选地，它们在胚蛋中给予或孵化后1或2天通过皮下(例如，s.c.)注射给予，以非常早期地提供免疫。本专利技术还提供了用于免疫禽的接种试剂盒，其包含以下组分：a.有效量的上述组合物，和b.用于向所述禽给予所述组合物的工具。本专利技术可用于在任何动物中表达多肽，优选地用于禽的接种，并且其适合于表达一种或数种多肽或肽、特别是禽病原体的免疫原性肽。附图简述图1说明了鸭肠炎病毒(DEV)基因组和重组DEV/rpsLneo-DsRed2的克隆区的位置(包括插入位点)的示意图。图2显示了重组DEV/rpsLneo-DsRed2基因组的图示，指示在PCR反应中扩增的接点1、接点2和接点3的位置，以证实病毒的基因组结构。图3说明了DEV基因组和pUC18-KAPEV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.30 EP EP15174515.51.鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因。2.权利要求1的DEV，其中所述UL4基因是突变的，或缺失的，或间断的。3.权利要求2的DEV，其中至少20％的所述UL4基因序列缺失，更优选至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。4.权利要求1-3中任一项的DEV，其进一步包含外源核酸。5.权利要求4的DEV，其中所述外源核酸位于失活的UL4基因中。6.前述权利要求中任一项的DEV，其中所述病毒包含位于UL4基因中的外源核酸，所述外源核酸置换了所有或部分的UL4基因序列。7.权利要求4的DEV，其中所述外源核酸位于选自以下的插入位点中：UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US4基因、US5基因、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因。8.权利要求4-7中任一项的DEV，其中所述外源核酸编码抗原或免疫刺激性分子，优选地来自禽病原体的抗原。9.权利要求8的DEV，其中所述抗原是禽副粘病毒1型的抗原性蛋白或肽，优选地新城疫病毒(NDV)的F蛋白或其片段，甘布罗病病毒的抗原性肽，优选地传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2蛋白或其片段，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的抗原性肽，优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：S于卡里，S赛托，
申请(专利权)人：法国诗华动物保健公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR