肠道病毒71型的新型病毒样颗粒、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种源于肠道病毒71型的新型病毒样颗粒及其应用。具体的，本发明专利技术将肠道病毒71型VP1蛋白截短后，仍能够获得肠道病毒71型的新型病毒样颗粒，且该病毒样颗粒的表达量高、免疫原性强、并显示了良好的特异性。

A new type of virus like granule of enterovirus 71, its preparation and Application

The present invention provides a new type of virus - like particles derived from the enterovirus 71 and its application. Specifically, the new virus like particles of enterovirus type 71 can still be obtained after truncating the enterovirus type 71 VP1 protein, and the virus like particles have high expression, strong immunogenicity and good specificity.

【技术实现步骤摘要】
肠道病毒71型的新型病毒样颗粒、其制备方法及应用
本专利技术属于生物医药领域，具体地说，本专利技术涉及肠道病毒71型的新型病毒样颗粒、其制备方法及应用。
技术介绍
肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员之一，是无包膜的单正链RNA病毒。成熟EV71病毒的衣壳由60个拷贝的VP1、VP2、VP3和VP4组成。EV71是引起手足口病的最主要病原体。虽然EV71感染通常表现为轻微的自限性疾病，但也可能导致严重的神经系统并发症，如脑干脑炎、脊髓灰质炎样瘫痪和肺水肿等症状，甚至是死亡。EV71病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLP)作为一种候选疫苗，已经在昆虫细胞表达系统和酵母表达系统中表达出来，大量临床前试验都证实了其可以在动物模型上诱导中和性抗体产生，并能提供保护来抵抗致死剂量的病毒感染。为了尽快的将EV71病毒样颗粒推向临床应用，本领域技术人员致力于降低EV71病毒样颗粒的制备成本，以及降低EV71病毒样颗粒的临床应用风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肠道病毒71型的新型病毒样颗粒、其制备方法及应用。本专利技术的第一方面，提供了一种肠道病毒71型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包括截短的VP1蛋白，与对应的野生型VP1蛋白相比，所述截短的VP1蛋白中至少截掉了野生型VP1蛋白的第X位至第Y位氨基酸残基，其中，X为1～8之间的正整数，Y为2～73之间的正整数。在另一优选例中，X为1～8之间的正整数,如1、2、3、4、5、6、7、或8。在另一优选例中，Y为15～45之间的正整数。在另一优选例中，Y为20～73之间的正整数，如20、25、30、35、或40。在另一优选例中，所述X为4。在另一优选例中，所述Y为30。在另一优选例中，所述野生型VP1蛋白的氨基酸残基编号依据SEQIDNO.3。本专利技术的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码本专利技术第一方面所述的病毒样颗粒的外壳蛋白的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述多核苷酸序列包括编码所述截短的VP1蛋白的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述截短的VP1蛋白的多核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的第三方面，提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。本专利技术的第四方面，提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞表达本专利技术第一方面所述的肠道病毒71型病毒样颗粒，或者所述的基因工程细胞含有本专利技术第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有肠道病毒71型外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有肠道病毒71型外壳蛋白的表达盒；所述基因工程细胞在胞内表达所述肠道病毒71型外壳蛋白，且所述外壳蛋白自组装形成所述病毒样颗粒(VLP)。在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞。在另一优选例中，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。本专利技术的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本专利技术第一方面所述的病毒样颗粒(VLP)、本专利技术第二方面所述的多核苷酸或者本专利技术第三方面所述的表达载体或者本专利技术第四方面所述的基因工程细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1.EV71的3CD和VP1部分截短的P1蛋白在毕赤酵母中的共表达。(A)本研究中所使用的质粒示意图。TRP2-L和TRP2-R，TRP区的上游和下游区域；PAOX1，醇氧化酶启动子；CYC1TT，CYC1转录终止区；ADE2，磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶，用作筛选标记；VP1Δ10-X,删掉VP1的第10位至第X位碱基。(B)EV71抗原在不同酵母克隆中的表达水平。不同酵母克隆的裂解液通过ELISA法测定EV71抗原含量，通过Bradford法测定总的可溶性蛋白(totalsolubleprotein,TSP)。空载体转化的酵母菌的裂解液来作为阴性对照(negativecontrol,ctr)。数据为三个复孔的平均值±SD。(C)抗VP0多抗作为检测抗体来进行Westernblotting检测。(D)抗VP1多抗作为检测抗体来进行Westernblotting检测。lane1，空载体转化的酵母菌；lane2，YE003转化的酵母菌；lane3，YE010转化的酵母菌；lane4，YE011转化的酵母菌。图2.VP1部分截短的VLPs组装的鉴定。(A-B)蔗糖梯度分析。YE010重组酵母菌的裂解液进行蔗糖梯度超离，每个样品从顶部到底部收取12个梯度组份。然后这些梯度组分通过(A)ELISA和(B)分别用抗VP0、抗VP1或抗VP3的抗体进行Westernblotting来分析。(C-D)VP1部分截短的VLPs的电镜分析。VLP-VP1Δ27，VP4蛋白截短27aa形成的VLPs；VLP-VP1Δ70，VP1蛋白截短70aa形成的VLPs。Bar＝100nm。图3.VLP-VP1Δ27在小鼠中诱导出高滴度的中和抗体。(A)VLP-VP1Δ27的SDS-PAGE分析。VLP-FL，全长的VLPs。(B)老鼠免疫后的EV71特异性的抗体反应。3组老鼠(每组6只)在第0周和第3周分别腹腔注射1ug/1剂的VLP-FL、VLP-VP1Δ27或PBS。在第5周收集血清，用昆虫细胞来源的VLPs作为包被抗原进行ELISA试验来检测EV71特异性的抗体反应。抗血清1:1000稀释，用于ELISA检测。每个符号代表一只老鼠，横线代表该组的几何平均值。(C)中和试验测定抗血清的中和滴度。对照抗原免疫老鼠的抗血清在最低稀释度1:16时没有显示任何中和活性，为了计算几何平均值，对照组的中和滴度定义为8。每个符号代表一只老鼠，横线代表该组的几何平均值。图4.VLP-VP1Δ27的母源免疫能保护幼鼠抵抗EV71的腹腔攻毒。(A-B)免疫VLP-FL、VLP-VP1Δ27或PBS的母鼠生下的小鼠7日龄时腹腔注射EV71/MAV-W。然后攻过毒的老鼠连续14天每天监测其(A)存活率和(B)临床症状。临床症状的评定标准为：0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。每组老鼠的数量都标在括号里面。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，意外地发现，将肠道病毒71型VP1蛋白进行特定截短后，仍能够获得肠道病毒71型的新型病毒样颗粒，且该病毒样颗粒仍然具有较强的免疫原性强、而且显示了良好的特异性，能够显著降低临床应用的风险。在此基础本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠道病毒71型病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒包括截短的VP1蛋白，与对应的野生型VP1蛋白相比，所述截短的VP1蛋白中至少截掉了野生型VP1蛋白的第X位至第Y位氨基酸残基，其中，X为1～8之间的正整数，Y为2～73之间的正整数。

【技术特征摘要】
1.一种肠道病毒71型病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒包括截短的VP1蛋白，与对应的野生型VP1蛋白相比，所述截短的VP1蛋白中至少截掉了野生型VP1蛋白的第X位至第Y位氨基酸残基，其中，X为1～8之间的正整数，Y为2～73之间的正整数。2.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，X为1～6之间的正整数,如1、2、3、4、5或6。3.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，Y为15～73之间的正整数。4.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，Y为30。5.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，X为4。6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄忠，张超，胡阳，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31