一种新城疫病毒拯救方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种新城疫病毒拯救方法，该方法在新城疫病毒基因组的cDNA的5’端引入锤头状核酶DNA序列，3’端引入丁肝核酶DNA序列，有效地保证了5’端和3’端的准确，同时使用转录载体pCMVTNT质粒上的CMV启动子，提高了转录效率和拯救效率，在BHK‑21细胞上拯救了新城疫病毒。本发明专利技术还涉及使用该方法拯救出的基因VII新城疫病毒弱毒株N7a。该毒株在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

Rescue method of Newcastle disease virus and its application

The invention relates to a Newcastle disease virus rescue method, the cDNA method in Newcastle disease virus genome of the 5 'end of the introduction of hammerhead ribozyme DNA sequence, 3' end of the introduction of HDV ribozyme DNA sequence, effectively ensure the 5 'and 3' ends accurately, while using the transcription vector pCMVTNT plasmid on CMV promoter, improve the efficiency and save the transcription efficiency in BHK 21 cells saved Newcastle disease virus. The present invention also relates to the attenuated NDV N7a of the gene VII rescued by this method. The strain has high titer and stable genetic performance in chicken embryo, which is suitable for large-scale production of vaccine and can be used for vaccine manufacture.

【技术实现步骤摘要】
一种新城疫病毒拯救方法及其应用
本专利技术涉及应用反向遗传操作技术，产生一种新城疫病毒拯救方法、使用该方法制备的新城疫病毒致弱株，以及该致弱株制备的疫苗组合物，属于生物

技术介绍
新城疫(Newcastledisease，ND)是禽副黏病毒9种血清型中的血清Ⅰ型禽副黏病毒(即新城疫病毒，NDV)引起的鸡和火鸡等多种禽类急性高度接触性传染病，常呈败血症症状。新城疫是一个严重的高度传染性病毒性疾病，由于其在全球许多国家分布广泛并可能造成重大的经济损失，是家禽行业的一个主要威胁。近年来，新城疫疫苗在世界范围内得到了广泛使用，但免疫鸡群中新城疫强毒感染仍然常见，同时，临床上新城疫病毒与其它呼吸道病原体协同致病的现象也较为常见，因此，新城疫仍然是当前困扰广大养殖户的重要疫病之一。从近十年来新城疫的流行特点来看，临床上所分离到的新城疫强毒大多数属于基因Ⅶ型，而常规的新城疫疫苗株的基因型主要为基因Ⅱ型(如LaSota、clone30、V4等)，新城疫流行株与常规疫苗株在遗传距离上相差较远，因此，常规疫苗对当前新城疫病毒强毒株的攻击并不能提供全面的免疫保护效力。在制备新的新城疫疫苗过程中，常使用新城疫病毒拯救方法对新城疫病毒株进行致弱，因此，新城疫病毒拯救方法的效率是毒株致弱成功的关键。因此，如果能使用高效率的新城疫病毒拯救方法对新的流行株进行致弱，开发出与临床流行毒株相匹配的、免疫原性良好的疫苗组合物，可以有效防止我国新城疫的流行。
技术实现思路
本专利技术涉及一种新城疫病毒拯救方法，其中，所述方法包括：步骤(1)，反转录所述新城疫病毒基因组RNA，制备所述新城疫病毒基因组的cDNA；步骤(2)，使用所述步骤(1)中获得的所述新城疫病毒基因组的cDNA，构建覆盖整个基因组的七个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体pCMVTNT质粒连接组装获得了完整cDNA克隆，在全长cDNA片段的5’端引入锤头状核酶DNA序列，3’端引入丁肝核酶DNA序列，得到pCMV-FL质粒；步骤(3)，分别构建三个克隆NP、P、L蛋白的辅助质粒；以及步骤(4)，将所述步骤(2)中构建的cDNA全长转录载体质粒和所述步骤(3)中获得的三个辅助质粒共转染BHK-21细胞，拯救出新城疫病毒株。本专利技术还涉及一种新城疫病毒的致弱方法，在所述拯救方法中将所述新城疫病毒的F基因裂解位点突变为弱毒株特征112G-R-Q-G-R-L117。本专利技术还涉及一种基因VII型新城疫病毒弱毒株，所述基因VII新城疫病毒弱毒株为新城疫病毒(基因VII型)，N7a株(NewcastleDiseaseVirus(genotypeⅦ),strainN7a)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：V201545，保藏时间为2015年10月19日。所述基因VII新城疫病毒弱毒株制备的疫苗组合物可以对流行基因Ⅶ型新城疫野毒株提供有效的免疫保护，显示出良好的免疫原性。本专利技术还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有免疫量的所述的基因VII型新城疫病毒弱毒株N7a或其培养物的抗原以及药学上的载体。本专利技术具有如下积极效果：本专利技术使用的反向遗传技术在新城疫病毒cDNA的5’端引入锤头状核酶DNA序列，该序列使得转录出的RNA具有准确的5’端，且促进了转录。同时该序列并未降低病毒在细胞上的复制增殖能力，保证了高的拯救效率。本专利技术方法在巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)控制下，依赖RNA聚合酶II，以自身带有CMV启动子的真核表达载体pCMVTNT作为骨架进行全长构建，在RNA聚合酶II的驱动下，负链病毒全长cRNA能够稳定表达，病毒拯救效率有效提高。本专利技术利用反向遗传技术成功拯救出了基因VII新城疫病毒弱毒株。该毒株在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。该毒株与我国新城疫病毒的优势流行株的基因型相一致，在控制当前新城疫的发病和流行方面显示了广阔的应用前景。附图说明图1为包含全长cDNA的质粒pCMV-FL的构建示意图，图1A为包含新城疫病毒cDNA的1、2、3片段的表达质粒的构建示意图，图1B为包含新城疫病毒cDNA的4、5、6、7片段的表达质粒的构建示意图，图1C为包含新城疫病毒全长cDNA的的表达质粒的构建示意图；图2为F基因裂解位点突变示意图；图3为全长cDNA的质粒pCMV-FL-N7a的酶切鉴定图，泳道1为XhoI酶切后的电泳图，泳道2为BglII酶切后的电泳图，泳道M为MarkerDL15000；图4为基因VII新城疫病毒致弱株N7a的RT-PCR鉴定结果图。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式进行说明。本专利技术涉及一种新城疫病毒拯救方法，其中，所述方法包括：步骤(1)，反转录所述新城疫病毒基因组RNA，制备所述新城疫病毒基因组的cDNA；步骤(2)，使用所述步骤(1)中获得的所述新城疫病毒基因组的cDNA，构建覆盖整个基因组的七个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体pCMVTNT质粒连接组装获得了完整cDNA克隆，在全长cDNA片段的5’端引入锤头状核酶DNA序列，3’端引入丁肝核酶DNA序列，得到pCMV-FL质粒；步骤(3)，分别构建三个克隆NP、P、L蛋白的辅助质粒；以及步骤(4)，将所述步骤(2)中构建的cDNA全长转录载体质粒和所述步骤(3)中获得的三个辅助质粒共转染BHK-21细胞，拯救出新城疫病毒株。作为本专利技术的一种实施方式，所述拯救方法步骤(1)中所述新城疫病毒为基因VII新城疫病毒株；所述拯救方法步骤(3)中所述辅助质粒为pCI-neo质粒。作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(2)中包括：根据病毒基因组测序结果和转录载体pCMVTNT中酶切位点的分析，将基因组分成7个片段，扩增病毒基因组全长，引物序列如下：PV1-F：5’-CCGGAGCTCAATCGAATCGTACGGGTAG-3’PV1-R：5’-CGGATCAATTCAGAAGGGTGCT-3’PV2-F：5’-CCGGAGCTCATCTCCTTACGTGACACA-3’PV2-R：5’-CGGGGTACCGTGTAGTTGCACTTCTT-3’PV3-F：5’-CCGGAGCTCAATGCTCTGCTTAGGAGTG-3’PV3-R：5’-CGGAGATCACAGTCGATAT-3’PV4-F：5’-CCGGAGCTCATGGTAATGATCTACT-3’PV4-R：5’-CGGGGTACCACTCTATCATCCTTGA-3’PV5-F：5’-TGCGAGCTCATTGTCTTAGTATCCA-3’PV5-R：5’-CGGGGTACCTCATTAGAGTTCAAAT-3’PV6-F：5’-TGCTCTTGAATGCATCCACTTAGCA-3’PV6-R：5’-CGGGGTACCAAGCAGATCGTACTT-3’PV7-F：5’-CCGGAGCTCATAGACTTCTCGAGGT-3’PV7-R：5’-TGCAATTGGCGTACGATTGCCT-3’，通过将扩增的7个cDNA片段在转录载体pCMVTNT质粒连接组装获得了包含完整本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新城疫病毒拯救方法，其特征在于，所述方法包括：步骤(1)，反转录所述新城疫病毒基因组RNA，制备所述新城疫病毒基因组的cDNA；步骤(2)，使用所述步骤(1)中获得的所述新城疫病毒基因组的cDNA，构建覆盖整个基因组的七个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体pCMVTNT质粒连接组装获得了完整cDNA克隆，在全长cDNA片段的5’端引入锤头状核酶DNA序列，3’端引入丁肝核酶DNA序列，得到pCMV‑FL质粒；步骤(3)，分别构建三个克隆NP、P、L蛋白的辅助质粒；以及步骤(4)，将所述步骤(2)中构建的cDNA全长转录载体质粒和所述步骤(3)中获得的三个辅助质粒共转染BHK‑21细胞，拯救出新城疫病毒株。

【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒拯救方法，其特征在于，所述方法包括：步骤(1)，反转录所述新城疫病毒基因组RNA，制备所述新城疫病毒基因组的cDNA；步骤(2)，使用所述步骤(1)中获得的所述新城疫病毒基因组的cDNA，构建覆盖整个基因组的七个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体pCMVTNT质粒连接组装获得了完整cDNA克隆，在全长cDNA片段的5’端引入锤头状核酶DNA序列，3’端引入丁肝核酶DNA序列，得到pCMV-FL质粒；步骤(3)，分别构建三个克隆NP、P、L蛋白的辅助质粒；以及步骤(4)，将所述步骤(2)中构建的cDNA全长转录载体质粒和所述步骤(3)中获得的三个辅助质粒共转染BHK-21细胞，拯救出新城疫病毒株。2.根据权利要求1所述的新城疫病毒拯救方法，其特征在于，所述拯救方法步骤(1)中所述新城疫病毒为基因VII新城疫病毒株；所述拯救方法步骤(3)中所述辅助质粒为pCI-neo质粒。3.根据权利要求2所述的新城疫病毒拯救方法，其中，所述步骤(2)中包括：根据病毒基因组测序结果和转录载体pCMVTNT中酶切位点的分析，将基因组分成7个片段，扩增病毒基因组全长，引物序列如下：PV1-F：5’-CCGGAGCTCAATCGAATCGTACGGGTAG-3’PV1-R：5’-CGGATCAATTCAGAAGGGTGCT-3’PV2-F：5’-CCGGAGCTCATCTCCTTACGTGACACA-3’PV2-R：5’-CGGGGTACCGTGTAGTTGCACTTCTT-3’PV3-F：5’-CCGGAGCTCAATGCTCTGCTTAGGAGTG-3’PV3-R：5’-CGGAGATCACAGTCGATAT-3’PV4-F：5’-CCGGAGCTCATGGTAATGATCTACT-3’PV4-R：5’-CGGGGTACCACTCTATCATCCTTGA-3’PV5-F：5’-TGCGAGCTCATTGTCTTAGTATCCA-3’PV5-R：5’-CGGGGTACCTCATTAGAGTTCAAAT-3’PV6-F：5’-TGCTCTTGAATGCATCCACTTAGCA-3’PV6-R：5’-CGGGGTACCAAGCAGATCGTACTT-3’PV7-F：5’-CCGGAGCTCATAGACTTCTCGAGGT-3’PV7-R：5’-TGCAATTGGCGTACGATTGCCT-3’，通过将扩增的7个cDNA片段在转录载体pCMVTNT质粒连接组装获得了包含完整cDNA克隆的pCMV-FL质粒；所述步骤(3)中包括：根据对真核表达载体pCI-neo及NP、P和L基因的酶切位点分析，设计五对引物扩增三个基因，L基因分成三个片段扩增，其中将GCCACC的kozak序列添加至每个上游引物酶切位点后。引物序列如下：NP-F：5’-TATTGAATTCGCCACCATGTCGTCTGTTTTCGACGAAT-3’NP-R：5’-TATAGTCGACTCAGTACCCCCAGTCAGTGTCGTT-3’P-F：5’-TATTGAATTCGCCACCATGGCTACTTTTACAGATGCGGA-3’P-R：5’-TATAGTCGACTCAACCATTCAGCGCAAGGCGT-3’L1-F：5’-TATTGCTAGCGCCACCATGGCGGGCTCCGGTCC-3’L1-R：5’-TATAGTCGACCAGGATTGGTTGGAATCTGACTG-3’L2-F：5’-AGATGGAACAATACTCAGTCAGGTC-3’L2-R：5’-TATAGTCGACTCTTCTCACTCAGGTTA-3’L3-F：5’-TCATTCACTCAAGGTTGAATGCAGT-3’L3-R：5’-TATAGTCGACTTAAGAGTCATTATTACTG-3’，通过将扩增的NP、P和L基因cDNA克隆至pCI-neo质粒获得了pCI-NP、pCI-P、pCI-L质粒。4.根据权利要求3所述的新城疫病毒拯救方法，其中，在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，程艺，孙进忠，张许科，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41