一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2‑ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2‑ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；和Cap重组蛋白包涵体变性步骤；和溶液置换及蛋白复性步骤：采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换与蛋白复性；和病毒样颗粒组装和回收步骤：使用中空纤维膜或膜包，以PBS对回收溶液进行超滤，浓缩；制备方法中蛋白复性效率高，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。

Method for preparing virus like particles of porcine circovirus type 2 and virus like particles obtained by this method

The invention discloses a method for preparing a porcine circovirus type 2 virus like particles, including the steps of preparation of porcine circovirus type 2 Cap inclusion body of recombinant protein: the full-length PCV2 ORF2 gene DNA encoding Cap protein encoding Cap protein has been removed or N terminal signal peptide sequence PCV2 ORF2 DNA fragment was inserted into the prokaryotic expression vector and transformed into Escherichia coli expression strain, induced expression of Cap recombinant protein; and Cap recombinant protein inclusion body denaturation step; and the solution replacement and refolding steps of denatured protein solution replacement and protein refolding solution using constant volume dialysis method; and the assembly of virus like particles and recovery steps using hollow fiber membrane or ultrafiltration membrane package, on the recovery, with PBS concentrated solution; preparation method of protein refolding efficiency, can be sustained, a large number of inclusion bodies prepared for virus like particles. Combined industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒
本专利技术涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒，属于生物培养

技术介绍
在猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗制备过程中，由PCV2-ORF2基因编码的Cap蛋白具有折叠为PCV2病毒样颗粒(VLP)的潜力而被作为PCV2亚单位疫苗抗原。在利用原核表达系统进行PCV2Cap蛋白重组表达过程中，工业化条件下过表达的PCV2Cap重组蛋白(rPCV2Cap)未与促溶蛋白进行融合表达，常常在细胞中堆积，形成不溶的形式的颗粒包涵体(InclusionBody，IB)；由IB形态的rPCV2Cap复性至蛋白天然构象或VLP具有较高的难度。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，蛋白复性效率高，以切向流超滤的方式，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA(序列如SEQIDNO.1所示)或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽(41个氨基酸残基)碱基序列的PCV2-ORF2DNA片段(序列如SEQIDNO.2所示)插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；Cap重组蛋白包涵体变性步骤：在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；溶液置换及蛋白复性步骤：在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；病毒样颗粒组装和回收步骤：在2-8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S-1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。进一步地，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤中，对包涵体进行纯化为使用含有2mol/L尿素的缓冲液对沉淀进行洗涤，用质量分数2％的TritonX-100溶液去除包涵体中的膜碎片和膜蛋白。进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S0包括20-100mMTris-Cl，30-100mMNaCl，50-150mM2-ME，5-7M盐酸胍，pH为11.5-12.5。进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S1包括20-100mMTris-Cl，30-100mMNaCl，50-150mM2-ME，pH为8-9。进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，第一上清液与Buffer-S1的体积比为1:5-20。进一步地，Cap重组蛋白包涵体变性步骤中，Buffer-S2包括20-100mMTris-Cl，30-100mMNaCl，50-150mM2-ME，6-8M尿素，pH为11.5-12.5。进一步地，溶液置换及蛋白复性步骤中，Buffer-RF包括20-80mMTris-Cl，80-200mMNaCl，0.5-2mMEDTA，1-10mM2-ME，5-10％甘油，3-8％PEG4000，100-300mML-精氨酸，0.1-0.5％Triton-X100，pH为5.5-6.5。进一步地，病毒样颗粒组装和回收步骤中，利用蠕动泵，泵速20～50mL/min条件下将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，一次超滤溶液和Buffer-AS的体积比为1:15-25。进一步地，病毒样颗粒组装和回收步骤中，Buffer-AS包括100-300mM柠檬酸铵，2-3％异丙醇，4-8％PEG4000，pH5-6。本专利技术的第二个目的在于提供一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒，通过上述的方法制备得到。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术的制备方法中，通过针对性地设计试剂，并配合制备步骤，在溶液置换及蛋白复性步骤中以中空纤维膜或膜包除去小分子量杂蛋白，病毒样颗粒组装和回收步骤中利用中空纤维膜或膜包除去未折叠为病毒样颗粒的杂蛋白，使得PCV2Cap重组蛋白原材料无需与亲和层析去除标签蛋白或促溶融合蛋白融合表达；2、本专利技术的制备方法中，蛋白复性效率高，并能稳定折叠形成PCV2VLP；3、本专利技术的制备方法中，利用切向流超滤的方式对PCV2VLP进行收集，回收率较高；4、本专利技术的制备方法中，将中空纤维膜或膜包串联，通过本专利技术可实现将包涵体大量、连续地制备病毒样颗粒，适合工业化生产。附图说明图1为实施例1电泳图；图2为实施例1透射电镜图；图3为实施例2电泳图；图4为实施例2透射电镜图。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：1、准备材料：配制溶液：Buffer-S0：20-100mMTris-Cl，30-100mMNaCl，50-150mM2-ME，5-7M盐酸胍，pH为11.5-12.5。Buffer-S1：20-100mMTris-Cl，30-100mMNaCl，50-150mM2-ME，pH为8-9。Buffer-S2：20-100mMTris-Cl，30-100mMNaCl，50-150mM2-ME，6-8M尿素，pH为11.5-12.5。Buffer-RF：20-80mMTris-Cl，80-200mMNaCl，0.5-2mMEDTA，1-10mM2-ME，5-10％甘油，3-8％PEG4000，100-300mML-精氨酸，0.1-0.5％Triton-X100，pH为5.5-6.5。Buffer-AS：100-300mM柠檬酸铵，2-3％异丙醇，4-8％PEG4000，pH5-6。对中空纤维膜或膜包进行预清洗和膜润湿、标准水透过率(NWP)测定、完整性测试。2、一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2-ORF2DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2‑ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2‑ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；Cap重组蛋白包涵体变性步骤：在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer‑S0中，4℃离心，取第一上清液；在0‑4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer‑S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer‑S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer‑S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20‑400μg/mL，得到变性蛋白溶液；溶液置换及蛋白复性步骤：在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer‑RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5‑8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0‑7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727‑3773S...

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2-ORF2DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；Cap重组蛋白包涵体变性步骤：在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；溶液置换及蛋白复性步骤：在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；病毒样颗粒组装和回收步骤：在2-8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S-1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。2.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤中，对包涵体进行纯化为使用含有2mol/L尿素的缓冲液对沉淀进行洗涤，用质量分数2％的TritonX-100溶液去除...

【专利技术属性】
技术研发人员：李中圣，王凤求，伍建敏，赵玉林，侯月娥，王贵平，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44