猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法技术

本发明专利技术提供了一种猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，该方法以获得猪圆环病毒2型病毒样颗粒为目的设计技术方案，利用杆状病毒表达系统提升了猪圆环病毒2型CAP蛋白的表达效率。此外，本发明专利技术在猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因基础上依据杆状病毒表达系统对密码子的偏爱性进行了基因修饰，从而显著提升了重组表达基因在杆状病毒表达系统中的表达效率。在此基础上，本发明专利技术针对杆状病毒表达系统以及CAP蛋白自身特点匹配了适宜的纯化条件，该纯化方法一方面具有较高的纯度的收率，另一方面电镜观察发现以此条件纯化的产物能够有效形成猪圆环病毒2型的病毒样颗粒(VLP)，从而保证了免疫原性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒抗原制备
，具体涉及猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法。
技术介绍
猪圆环病毒(PCV)首次发现于1974年，Tischer等人从污染的猪肾细胞系PK-15(ATTC-CCL33)中分离到一种类似圆环病毒的新病毒，定名为猪圆环病毒(PCV)。血清学调查表明，猪圆环病毒抗体在猪群中长期存在，但没有相关证据表明何种疾病是该病毒感染引发的。因此，在当时人们认为该病毒是非致病性的。一年之后，北美和欧洲在断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)患病猪身上提取的组织中分离出类似猪圆环病毒的病原体。人们将最初无致病性的猪圆环病毒和与PMWS爆发有关的新发现的分离病毒进行比较，发现这两个病原体在基因结构和抗原性上均有不同。因此，猪圆环病毒被分为两个亚型：从PK-15细胞系中分离出的无致病性的病毒被命名为猪圆环病毒1型(PCV1)；从患病猪身上分离出的猪圆环病毒被命名为猪圆环病毒2型(PCV2)。目前，流行病学调查显示，PCV2已经在世界范围内广泛分布，规模化养殖场几乎没有血清阴性的猪。自PMWS首次在加拿大爆发至今，全世界五大洲均诊断出PMWS的感染，对大多数养猪国造成了极大的威胁。PCV2是目前已知的最小的病毒之一，其基因组是一条共价闭合的单链DNA，近似于1.76kb～1.77kb。一般认为PCV2有11个开放阅读框(openreadingframes，ORFs)，然而仅有三个开放阅读框被认为可以编码蛋白。其中ORF2又称为CAP基因，位于互补链上，呈逆时针方向，负责编码唯一的结构蛋白CAP，其氨基酸长度为233aa～234aa。CAP蛋白也是PCV2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生。由于防治PCV2的重要性，有关PCV2疫苗的制备成为生物制品研发的热点之一。现有技术的PCV2疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，但由于PCV2在体外细胞中培养难度大，增殖力弱，导致现有技术的PCV2疫苗存在滴度较低，成本较高的缺陷。另一方面，PCV2亚单位基因工程疫苗则有效克服了灭活疫苗和减毒活疫苗的上述缺陷，它是通过原核或真核表达系统表达PCV2的结构蛋白CAP，再以此来制备PCV2的病毒样颗粒(Viruslikeparticles,VLP)，该VLP不含有病毒核酸，却具有与病毒相似的衣壳结构，能够作为抗原诱导机体免疫应答，进而产生抗体。然而，现有技术中PCV2的CAP蛋白表达效率较低，这一方面是由于表达系统本身不适于CAP蛋白表达基因的表达，另一方面也反应出CAP蛋白表达基因与现有技术的表达系统不能较好的契合，这严重影响了抗原的产量及后续疫苗的制备。那么如何针对CAP蛋白表达基因自身特点获取一套适宜的表达系统和配套的工艺方法，同时实现CAP蛋白表达基因与表达系统的高效契合，将成为提升抗原制备效率的关键。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，以解决现有技术中猪圆环病毒2型CAP抗原表达水平较低的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术的猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法操作繁琐的技术问题。本专利技术要解决的再一技术问题是由于现有技术的猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，所制备的CAP蛋白难以形成病毒样颗粒，因此免疫原性较差的技术问题。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，该方法是将猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因整合到质粒上得到重组质粒，而后将所述重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因是在猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因基础上，以杆状病毒偏嗜密码子替换其中的杆状病毒非偏嗜密码子所修饰后的基因；在此基础上进一步优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。在该优选技术方案中，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因，是指自然条件下野生型猪圆环病毒2型的CAP蛋白表达基因；所述的修饰，是指对基因的改造，这种改造行为应当保证改造前和改造后所表达的蛋白氨基酸序列不变。优选的，所述杆状病毒表达系统是flashBAC杆状病毒表达系统。在该优选技术方案中，所述flashBAC杆状病毒表达系统专指由英国OxfordExpressionTechnologies公司(OET公司)出品的型号为“flashBAC”的杆状病毒表达系统。优选的，所述杆状病毒表达系统以sf9昆虫细胞作为宿主细胞。优选的，所述质粒是杆状病毒转移载体pOET3。优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因是利用BamHI和XhoI双酶切方法获得的；在此基础上进一步优选的，是先将猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因克隆至pUC57载体，而后再利用BamHI和XhoI双酶切方法得到大量的猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因。优选的，将目的基因克隆至杆状病毒转移载体pOET3得到重组质粒后，将所述重组质粒利用脂质体转染法导入宿主细胞表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。优选的，将重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白后，取宿主细胞培养液上清反复冻融，而后通过60～80KD菲托滤板去除细胞碎片，再通过4～6KD滤膜浓缩，再离心浓缩，即得到所述猪圆环病毒2型CAP抗原；在此基础上进一步优选的，所述离心浓缩是先以80000～120000g的速度超速离心，取沉淀，重悬，而后以20～40％蔗糖密度梯度、130000～170000g的速度超速离心，取中间层即得到所述猪圆环病毒2型CAP抗原。该技术方案还可以执行以下优选：所述冻融是反复冻融3次；所述菲托滤板的孔径为70KD；所述滤膜的孔径为5KD；所述离心浓缩是先以100000g的速度超速离心2h，取沉淀，重悬，而后以20～40％蔗糖密度梯度、150000g的速度超速离心3h，取中间层即得到所述猪圆环病毒2型CAP抗原。优选的，得到重组质粒后，先将该重组质粒转化至大肠杆菌中，利用大肠杆菌复制该重组质粒，再将复制后的重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白；更优的，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α。本专利技术充分利用了杆状病毒表达系统对外源基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、翻译后加工修饰系统完备和表达外源基因能力强等技术特点，显著提升了猪圆环病毒2型CAP蛋白的表达效率本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，其特征在于该方法是将猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因整合到质粒上得到重组质粒，而后将所述重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。

【技术特征摘要】
1.猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，其特征在于该方法是将猪圆环病毒
2型CAP蛋白表达基因整合到质粒上得到重组质粒，而后将所述重组质粒利用
杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述猪圆环病毒2型CAP
蛋白表达基因是在猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因基础上，以杆状病毒
偏嗜密码子替换其中的杆状病毒非偏嗜密码子所修饰后的基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述猪圆环病毒2型CAP
蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQIDNO2所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述杆状病毒表达系统是
flashBAC杆状病毒表达系统。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述杆状病毒表达系统以
sf9昆虫细胞作为宿主细胞。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述质粒是杆状病毒转移
载...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧娟，吕茂杰，杨保收，付旭彬，梁武，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12