一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用，本发明专利技术为了获得可溶性重组PCV2 Cap蛋白，采用PCR方法将MPG与NLS部分缺失的Cap蛋白N端基因融合构建成新的基因，然后克隆至大肠杆菌表达载体pET28a，获得重组质粒，转化至大肠杆菌BL21得重组工程菌，重组工程菌用IPTG诱导表达获得可溶性重组PCV2 Cap蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，本发明专利技术所得重组蛋白MrCap大部分存在于细菌裂解上清液中，呈可溶性，且该重组蛋白MrCap具有较高的免疫原性和免疫反应性，为PCV2抗体检测试剂盒和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的编码重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的基因及该基因编码的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，还涉及该重组蛋白的制备方法以及应用。
技术介绍
猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是与许多猪病相关的重要病原体，最初于1996年在加拿大西部被发现，之后被报道为一种新的综合征，名为仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是最小的动物病毒之一，基因组全长约1.7kb，是单股环状的DNA病毒。有两个比较大的开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码Rep和Cap蛋白，Rep主要参与病毒的复制，Cap是病毒的结构蛋白，可以聚集形成病毒的二十面体衣壳。PCV2Cap蛋白免疫原性高、可与感染PCV2的猪血清反应，因此，Cap蛋白可用作设计新型PCV2疫苗的抗原分子，近年来成为疫苗研究的最主要靶抗原。近年来，原核和真核表达系统被用于表达Cap蛋白，用于抗PCV2动物免疫。在真核表达系统中，重组蛋白最重要的特性是能通过自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，重组Cap蛋白最先在杆状病毒表达系统中成功表达，并已经开放成功重组杆状病毒亚单位疫苗。然而，任何真核表达系统表达蛋白的成本都很高，在应用上受到限制，而原核表达系统则正好相反，成本低廉。但原核表达也存在难点，例如大肠杆菌表达Cap蛋白最大的困难在于Cap蛋白的N端是一段富含碱性氨基酸的高度保守序列，1-41位氨基酸是Cap蛋白的核定位信号肽序列(NLS)，NLS上的特异性氨基酸使Cap蛋白表达水平很低，即使将Cap基因与GST、MBP等蛋白融合，其表达水平仍然很低。此外，Cap蛋白大肠杆菌系统表达产物多以包涵体形式存在，使应用进一步受到限制。细胞分泌型多肽(CPPs)，或称为蛋白传输域(PTDs)、细胞穿透肽(cellpenetratingpeptides)、细胞穿膜肽，是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，可有效提高不同生物分子的细胞间转移，包括质粒DNA、寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、多肽核苷酸(PNA)、蛋白和多肽，以及脂质体纳米颗粒在体内体外转移进细胞或组织，可作为将具有生物学活性的分子转运进入细胞的工具。目前没有将CPPs与Cap蛋白进行融合的报道出现。
技术实现思路
本专利技术针对重组Cap蛋白的存在形态以及原核表达存在的难点，提供了一种新的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因、含有该基因的重组质粒和重组工程菌，该重组工程菌能表达可溶性重组PCV2Cap蛋白。本专利技术还提供了上述基因编码表达的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，该蛋白具有很好的抗原性和免疫原性，且为可溶性蛋白，更便于应用。本专利技术还提供了制备上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，该方法操作简便，易于实现。本专利技术还提供了以上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为有效成分的亚单位疫苗和PCV2抗体诊断试剂盒。本专利技术为了提高Cap蛋白的表达水平以及存在形态，将Cap蛋白N端的前10个氨基酸去除，同时与细胞分泌型多肽进行融合，得到融合蛋白，或者也可以称为重组PCV2Cap蛋白、重组蛋白、重组Cap蛋白。该重组PCV2Cap蛋白是由重组基因表达获得，根据设计的特殊引物序列，扩增出重组基因，重组基因是由缺失的Cap基因与细胞分泌型多肽基因拼接得到的，缺失的Cap基因是缺失编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列的Cap蛋白基因。将该重组基因插入质粒获得重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌得到重组工程菌，重组工程菌表达得到可溶性重组PCV2Cap蛋白。细胞分泌型多肽CPPs包括蛋白型(P)、嵌合型(C)和合成型(S)。本专利技术使用MPG、ppTG20、TAT三种细胞分泌型多肽进行研究，MPG属于C型，C型CPPs部分源于自然多肽或蛋白，如蛋白的信号序列可被受体蛋白识别，以协助未成熟的蛋白经翻译后转移到细胞间组分的膜上。MPG嵌合了HIVgp41的融合序列和SV40T抗原的NLS，其基因序列为GGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTT，氨基酸序列为：Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。ppTG20属于S型，是一种α螺旋S型CPPs，其基因序列为：GGTCTGTTCCGAGCACTGCTGCGACTGCTGCGATCTCTGTGGCGACTGCTGCTGCGAGCA，氨基酸序列为：Gly-Leu-Phe-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala。TAT属于P型，是涉及HIV复制的氨基酸86-102位点的转录激活因子，基因序列为：TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA，氨基酸序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。以缺失的Cap基因为模板，分别与MPG、ppTG20、TAT基因拼接，得到重组基因，将所得重组基因分别进行原核表达得到三种重组PCV2Cap蛋白。经实验验证，仅有与MPG拼接形成的MPG-Cap(简称MrCap)重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，且可溶性蛋白表达量高，实现了Cap蛋白目的基因可溶性表达。而ppTG20-Cap(简称prCap)和TAT-Cap(简称TrCap)重组蛋白主要以包涵体的形式存在，可溶性蛋白表达量低，应用性不强。本专利技术具体技术方案如下:一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因(简称重组PCV2Cap基因)，该基因是在缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合细胞分泌型多肽MPG的基因序列所形成的，所述缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列。进一步的，本专利技术编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的序列如SEQIDNO.1所示。在知道了该编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的情况下，可以通过PCR扩增的方式得到该基因。本专利技术还提供了一种重组质粒，该重组质粒是将上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因插入pET28a(+)质粒中构建而得。本专利技术还提供了一种重组工程菌，该重组工程菌是将上述重组质粒转化入大肠杆菌中而得。所述大肠杆菌可以为大肠杆菌BL21。本专利技术还提供了扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征是：该基因是在缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合细胞分泌型多肽MPG的基因序列所形成的，所述缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是编码NLS 中N端前10个氨基酸的基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征是：该基因是在缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合细胞分泌型多肽MPG的基因序列所形成的，所述缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征是：该基因的序列如SEQIDNO.1所示。
3.一种扩增编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的引物，其特征是：依次以下述a、b、c三对引物进行三次PCR扩增最终得到权利要求1或2所述的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因；
引物a：
上游引物：5'-ATAGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCA-3'
下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'
引物b：
上游引物：5'-ATACCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCA-3'
下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'
引物c：
上游引物：5'-ATAGGATCCGGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGT-3'
下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'。
4.一种重组质粒，其特征是：将权利要求1或2所述的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因插入pET28a（+...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜平，周雪晨，白娟，曹晶晶，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京科宏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32