重组人VEGF多肽肿瘤疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人VEGF多肽肿瘤疫苗，利用人工合成的方法获得人VEGF抗原表位核酸序列，将其插入噬菌体Qβ外壳蛋白基因的C末端，利用共表达系统在大肠杆菌BL21（DE3）中同时表达噬菌体Qβ外壳蛋白以及C末端插有人VEGF抗原表位的Qβ外壳蛋白，经纯化后获得在外表呈递有人VEGF抗原表位的Qβ病毒样颗粒。本发明专利技术的重组人VEGF‑Qβ蛋白通过免疫小鼠产生抗人VEGF抗体，该抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF

【技术实现步骤摘要】
重组人VEGF多肽肿瘤疫苗
本专利技术涉及医学生物技术及免疫学领域，具体地，涉及人VEGF多肽疫苗的构建方法。技术背景研究表明，血管生成在肿瘤的发生发展中具有重要作用，抑制肿瘤血管生成已成为一种新的治疗方法。许多活性因子已被确认参与这个复杂的过程，其中包括：aFGF、bFGF、TGF-α、VEGF等。然而，过去数年所做的研究已确立在肿瘤血管生成中，血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知的一个最有效的和最特异的促血管生成因子。在大多数肿瘤中，VEGFmRNA是过度表达的，因而被认为是抑制肿瘤血管生成最有效的靶标。多种策略已被用来抑制VEGF的作用，其中包括靶向VEGF受体(VEGFR)、使用基因疗法提供反义寡核苷酸、使用可溶性VEGFR、受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂的开发,以及针对VEGF的单克隆抗体。目前最有前景的方法是重组的人源化的小鼠抗人VEGF单克隆抗体。此抗体已经在转移性癌症患者进行过测试。然而,运用抗体进行治疗有很多缺点，重要的是，被动免疫策略牵涉把抗体注入病人体内,它的免疫力是短暂的，因为抗体在机体循环中会很快被清除。其次，单克隆抗体本身也是免疫原，导致其不能长期使用。再者，为了维持有效的免疫必须持续大量给患者输入抗体，患者须承受严重的经济负担。使用疫苗来预防或治疗肿瘤是一种极具吸引力的方式，因为疫苗疗法的预期副作用最小。抗肿瘤疫苗包括完整的细胞疫苗、蛋白质和DNA疫苗,以及肽疫苗；每种类型的抗肿瘤疫苗都有其优点和局限性。用肽制备的抗肿瘤疫苗目前引起研究者很大的兴趣，因为这种形式的疫苗较为安全（没有病原体和致癌物质的潜在威胁）、稳定及容易制备，能够大大降低经济成本。重要的是，相对于被动免疫而言，肽疫苗能够致使机体产生持续的免疫反应和记忆。但是肽疫苗的缺陷在于未经修饰的肽极少具有免疫原性。我们通过将VEGF抗原肽呈递在高度有序、高度重复的Qβ病毒样颗粒上赋予了其极高的免疫原性，有望作为一种有效的方法来预防或治疗肿瘤的发生发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，将人VEGF抗原肽呈递在高度有序、高度重复的Qβ病毒样颗粒上赋予其极高的免疫原性，为肿瘤免疫治疗提供一种新的治疗药物。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种重组人VEGF多肽肿瘤疫苗，其特征在于，利用共表达系统在大肠杆菌BL21（DE3）中同时表达噬菌体Qβ外壳蛋白以及C末端插有人VEGF抗原表位的Qβ外壳蛋白，经纯化后获得在外表呈递有人VEGF抗原表位的Qβ病毒样颗粒。该融合蛋白疫苗的特点是，用该疫苗免疫小鼠后，小鼠体内可产生高滴度的抗人VEGF抗体，并且该抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF165的生物学活性。并且利用这种呈递方式获得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可对C57BLACK6小鼠体内的TC-1肿瘤细胞起到一定的抑制作用。附图说明图1显示了通过共表达纯化后得到的病毒样颗粒；图2显示重组人VEGF多肽疫苗加铝佐剂免疫小鼠后产生了较好的抗体应答；图3显示重组人VEGF多肽疫苗加铝佐剂免疫小鼠后产生的特异性抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF165的生物学活性。图4显示利用共表达将抗原肽呈递在Qβ病毒样颗粒表面的方式获得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可对C57BLACK6小鼠体内的TC-1肿瘤细胞起到一定的抑制作用。具体实施方式依照本专利技术的技术方案，采用人工合成的方法获得人VEGF抗原肽的核酸序列，将其插入噬菌体Qβ外壳蛋白基因的C末端，利用共表达的方式在大肠杆菌BL21（DE3）中同时高效表达噬菌体Qβ外壳蛋白以及C末端插有人VEGF抗原肽的Qβ外壳蛋白，表达产物经超声破碎、硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心的纯化得到外表呈递有人VEGF抗原肽的Qβ病毒样颗粒疫苗。该疫苗与铝佐剂混合后免疫小鼠获得的特异性抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF165的生物学活性。同时，通过此方法利用与人VEGF抗原肽同源的小鼠VEGF抗原肽构建的疫苗免疫小鼠后能抑制C57BLACK6小鼠体内TC-1肿瘤细胞的生长。实施例实施例1：重组人VEGF多肽疫苗原核表达质粒的构建采用人工合成的方法获得C末端带有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的噬菌体Qβ外壳蛋白基因表达序列，并克隆入载体pRSFDuet1第一个表达单元中，同时将合成的上游引入BamHⅠ，下游引入EcoRⅠ酶切位点的人VEGF抗原肽核酸序列连接在Qβ外壳蛋白基因表达序列的C末端；在载体pRSFDuet1第二个表达单元中插入噬菌体Qβ外壳蛋白基因表达序列。实施例2：重组人VEGF多肽疫苗原核表达将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单克隆至含有卡那霉素（50mg/mL）的LB培养基中，过夜培养12-16小时后按1:20的比例转接至含卡那霉素的新鲜LB培养基中继续培养2-3小时，待菌液OD值达到0.5时，加入IPTG（1mmol/L）诱导表达3小时，诱导温度37℃。实施例3：重组人VEGF多肽疫苗的纯化诱导表达后的菌液以4500rpm离心20min收集菌体，将菌体用PBS重悬后进行超声破碎，条件为15%的功率，工作5sec，停5sec，总时间10min。超声破碎后的样品以12000rpm离心10min，取上清加入硫酸铵至饱和度为40%，4℃混匀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS溶解，溶解产物用10-50%的蔗糖溶液进行密度梯度离心（40000rpm，3h），将含有病毒样颗粒的条带取出，经G-25脱盐纯化柱将蔗糖置换成PBS得到纯化好的重组人VEGF多肽疫苗（图1）。实施例4：重组人VEGF多肽疫苗的动物免疫将纯化后的疫苗50ug与40mg/mL的铝佐剂按3:1的体积比混合后分别在0天、14天、28天进行三次皮下免疫小鼠，第三次免疫后一周采血用ELISA进行人VEGF特异性抗体的检测（图2）。以此证明经重组人VEGF多肽疫苗免疫后，小鼠产生了高水平的特异性抗人VEGF抗体应答。实施例5：免疫小鼠血清中IgG抗体的纯化用4倍体积的醋酸钠缓冲液(60mM，pH值4.0)稀释血清，用0.5M的氢氧化钠调pH值至4.5。将辛酸(25μl/ml)逐滴加入样品中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌30min，8000r/min离心30min，取上清，按上清液10份加1份10xPBS混合,用0.5M的氢氧化钠调pH值至7.4。加入硫酸铵(0.277g/ml)搅拌30min后，8000rpm/min离心15min，弃上清液，将沉淀悬浮于PBS(起始腹水体积的1/5-1/10)中。悬浮液用100倍体积的PBS透析过夜。实施例6：内皮细胞生长分析将HUVEC细胞以3×103个细胞/孔的密度接种于96孔板，在含有1%牛血清的DMEM培养基中过夜培养，然后加入不同浓度（0.39-100ng/ml）从小鼠血清中纯化的IgG抗体以及VEGF165至终浓度25ng/ml，培养三天后加入10%的CCK-8，反应4-8小时后在450nm波长处读取吸光度值（图3）。实施例7：体内肿瘤研究分别将纯化的Qβ载体、人多肽VEGF疫苗以50ug/只的剂量皮下免疫C57BLACK6小鼠，以等体积PBS进行相同免疫作为空白组对照。每组8只小鼠，添加铝佐剂，每本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人VEGF多肽肿瘤疫苗经主动免疫动物后，可以突破动物自身的免疫耐受，诱发出抗自身VEGF蛋白的抗体，从而拮抗VEGF的病理性功能，抑制动物肿瘤生长。

【技术特征摘要】
1.一种重组人VEGF多肽肿瘤疫苗经主动免疫动物后，可以突破动物自身的免疫耐受，诱发出抗自身VEGF蛋白的抗体，从而拮抗VEGF的病理性功能，抑制动物肿瘤生长。2.权利要求1中所述重组人VEGF多肽肿瘤疫苗，其构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：马雁冰，白红妹，黄惟巍，夏烨，刘存宝，孙文佳，杨旭，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53