本发明专利技术涉及用于制备树突状细胞的方法、通过该方法制备的树突状细胞及其用途，更具体地涉及：用于制备树突状细胞的方法，包括在未成熟树突状细胞成熟步骤中用与能够穿透细胞膜的肽结合的抗原处理细胞以将其对该抗原致敏；通过所述方法制备的树突状细胞，及其免疫治疗剂；用于抗肿瘤疫苗的用途、或含有所述树突状细胞的用于治疗肿瘤的药物组合物。
Method for preparing dendritic cells, dendritic cells prepared by the method, and uses thereof
The present invention relates to dendritic cells prepared by this method, method for the preparation of dendritic cells and the use thereof, more particularly relates to a method for preparing: dendritic cells in immature dendritic cells, including the steps and can penetrate the cell membrane of the peptide binding antigen processing cells to the antigen sensitized; through the method of preparation of dendritic cells and immune therapeutic agent; for use, anti tumor vaccine or pharmaceutical composition for treating tumors containing the dendritic cells.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于制备树突状细胞的方法、由其制备的树突状细胞及其用途，并且更具体地涉及：用于制备树突状细胞的方法，所述方法包括用与具有细胞膜通透性的肽结合的抗原处理在成熟期而非在未成熟期的树突状细胞以制备具有改善的抗原呈递能力的树突状细胞；通过所述方法制备的树突状细胞；及其免疫治疗剂、用于抗肿瘤疫苗的用途、或含有所述树突状细胞的用于治疗肿瘤的药物组合物。
技术介绍
树突状细胞是专职抗原呈递细胞(APC)，在体内的免疫诱导和免疫调节中起重要作用。人体中的树突状细胞仅占总白细胞的0.3％，但它们是能够激活从未接触过抗原的未免疫T细胞以诱导初级免疫应答，并能诱导抗原特异性获得性记忆免疫的免疫细胞。树突状细胞能够充当专职抗原呈递细胞的原因是在细胞表面上除了主要组织相容性复合物(MHC)I/II之外还高度表达共刺激分子，如CD80和CD86以及粘附分子，如ICAM-1，并且大量分泌与T细胞活化相关的各种细胞因子(干扰素，IL-12，IL-18等)。如上所述，由于树突状细胞能够有效地诱导或调节抗原特异性T细胞活性，已经长时间研究了树突状细胞用作癌症或难治性免疫疾病的治疗剂的可能性。发现当用抗原致敏直接从组织或血液分离的树突状细胞或从单核细胞分化的树突状细胞并且将成熟的树突状细胞注射回身体中时，它诱导专门的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，因此，已经长时间研究了开发树突状细胞作为用于治疗癌症或感染性疾病的疫苗的可能性(Inaba,K.etal.,3.Exp.Med.,178:479,1993；Inaba,K.etal.,Int.Rev.Immunol.,6:197,1990；Hsu,F.etal.,NatureMed.,2:52,1996)。基于这些早期研究结果，已经在全世界积极地进行树突状细胞疗法用于癌症治疗的临床研究，并且已经在各种癌症中报告了结果。然而，用单一治疗的临床效果小于初始的预期。树突状细胞疗法尚未获得成功的已知原因是由于肿瘤细胞的低免疫原性和由癌细胞分泌的免疫抑制物质。在这种情况下，如果树突状细胞能够诱导更专门的抗癌免疫力以克服肿瘤细胞的低免疫原性并诱导能够超越肿瘤细胞的免疫抑制能力的抗癌免疫，则可以大大改善治疗效果。在这些情况下，本专利技术人发现，当用重组抗原致敏成熟期而非未成熟期的树突状细胞时，其中抗原与具有细胞膜通透性的功能肽，如胞质转导肽[CTP:Kim,D.etal.ExpCellRes.312(8):1277-88,2006]结合，可以制备与常规树突状细胞相比具有明显改善的淋巴结迁移能力、T细胞增殖能力、细胞毒性T淋巴细胞诱导能力等的树突状细胞，并确认可以提供使用所述树突状细胞的免疫治疗剂和使用所述树突状细胞的用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供制备具有改善的细胞毒性T淋巴细胞诱导能力和改善的功能的树突状细胞的方法、通过该方法制备的树突状细胞、以及含有所述树突状细胞的用于治疗肿瘤的抗肿瘤疫苗或药物组合物。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供了制备树突状细胞的方法，包括用结合与具有细胞通透性的肽的抗原致敏用成熟因子处理和培养的树突状细胞。本专利技术还提供通过该方法制备的树突状细胞。本专利技术还提供含有树突状细胞的免疫治疗剂。本专利技术还提供含有该树突状细胞的抗肿瘤疫苗。本专利技术还提供了含有树突状细胞的用于治疗肿瘤的药物组合物。附图说明图1a至1d显示如下结果。图1a显示了在本专利技术的示例性实施方案中制备的树突状细胞的迁移能力，其通过用具有细胞通透性的肽处理从未成熟阶段至O/N(20小时)的未成熟的树突状细胞，并通过在成熟过程期间在细胞收获前4小时用相同抗原处理制备。图1b显示了图1a的树突状细胞培养基中IL-12浓度的分析结果。图1c显示了当共培养图1a的树突状细胞和自体T细胞时的T细胞增殖能力的分析结果。图1d显示了图1c的培养基中IFN-γ的ELISA分析结果。图2a至2e显示如下结果。图2a显示了用根据本专利技术的示例性实施方案的在不同抗原致敏时间时制备的树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的数目的分析结果。图2b显示了根据实施例(图2a)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)期间在培养基中分泌的IFN-γ的浓度的分析结果。图2c显示了检查实施例(图2a)中制备的CTL(效应细胞)的细胞毒作用活性的结果。图2d显示了当共培养实施例(图2c)的CTL(效应细胞)和靶细胞时培养基中分泌的IFN-γ的浓度的分析结果。图2e显示了使用IFN-γELISPOT测定法在实施例(图2a)中诱导的CTL的抗原特异性的分析结果。图3显示了根据本专利技术的示例性实施方案制备的树突状细胞的表型分析结果。图4a至4f显示了如下结果。图4a显示了在O/N(20小时)时或细胞收获前4小时用与或不与CTP(细胞质转导肽)组合的抗原致敏的树突状细胞的表型分析结果。图4b显示了当共培养实施例(图4a)的树突状细胞和自体T细胞时培养基中IFN-γ的ELISA分析结果。图4c显示了由实施例(图4a)的树突状细胞诱导的CTL的CD8阳性细胞的分析结果。图4d显示了在用实施例(图4a)的树突状细胞诱导CLT的过程期间在上清液中IFN-γ的ELISA分析结果。图4e显示了使用IFN-γELISPOT得到的由实施例(图4a)的树突状细胞诱导的T细胞的抗原特异性免疫应答的分析结果。图4f显示了通过使用胞内染色法检查由实施例(图4a)的树突状细胞诱导的T细胞中的表达颗粒(颗粒酶B)的CD8阳性细胞获得的测试结果。图5显示了使用经罗丹明标记的Ag得到的未成熟树突状细胞(imDC)和成熟树突状细胞(mDC)之间的抗原(CTP-PSA或X-PSA)摄取能力的比较分析结果。图6显示了树突状细胞的免疫活性根据CTP抗原处理时间的比较分析结果，图6a显示了CTP-GPC3处理方法的示意图，图6b显示了当共培养相应的树突状细胞与自体T细胞时，使用ELISA方法分析培养基中IFN-γ的结果。具体实施方式除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本专利技术所属领域的技术人员的通常理解相同。一般情况下，本文使用的命名法是本领域公知的并且通常采用的。在用于制备树突状细胞的常规方法中，由于成熟树突状细胞的抗原摄取能力远低于未成熟细胞的抗原摄取能力，故利用在树突状细胞成熟之前递送抗原的方法(韩国专利申请公开号2004-0025690)。此外，要递送的抗原的类型是mRNA、DNA、癌细胞或组织的裂解物，被杀死或凋亡诱导的癌细胞，重组蛋白和短肽，并且在树突状细胞上直接处理这些抗原或使用诸如与树突状细胞共培养、电穿孔，lipofectamine等方法将这些抗原递送到树突状细胞。特别地，在电穿孔的情况下，转染效率随递送的细胞不同差异较大，即使电穿孔培养24小时后显示高细胞存活力，但显示的细胞回收率较低。使用脂质囊泡如脂质体递送抗原的方法也显示低转染效率、物理化学不稳定性、低乳液稳定性和收集效率，并且需要除去溶剂的程序，因此存在制造工艺复杂、制造成本增加等许多问题。根据本专利技术，在通过成熟因子处理培养树突状细胞的过程中，在培养基中简单地处理结合于具有细胞膜通透性的肽的重组抗原，使得抗原通过细胞膜，并且在没有树突状本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备树突状细胞的方法，包括用结合于具有细胞通透性的肽的抗原致敏经成熟因子处理和培养的树突状细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.01 KR 10-2014-00992811.一种用于制备树突状细胞的方法，包括用结合于具有细胞通透性的肽的抗原致敏经成熟因子处理和培养的树突状细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有细胞通透性的肽包括细胞质转导肽(CTP)。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述成熟因子选自下组中之一：白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)、溶链菌制剂(Picibanil)(OK-432)、PolyIC、mTOR抑制剂、及上述两者以上的组合。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述mTOR抑制剂选自下组中之一：雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、ridaforolimus、NVP-BEZ235、SF-1126、XL-765、PKI-587、PF-04691502、PKI-402、OSI-027、AZD...
【专利技术属性】
技术研发人员：李润，金永穆，金小莲，韩承洙，裵容洙，
申请(专利权)人：JW可瑞基因株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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