树突状细胞的培养方法和树突状细胞技术

本发明专利技术涉及一种树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，获得未成熟树突状细胞；然后，再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；其中，第一诱导剂包括：rhGM-CSF和rhIL-4；第二诱导剂包括rhTNF-α、番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。本发明专利技术进一步涉及由上述方法所获得的树突状细胞。与现有技术相比，本发明专利技术提供的方法提高树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程领域，特别涉及一种树突状细胞的培养方法和树突状细胞。
技术介绍
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段,也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前在临床中使用最多的细胞免疫治疗疗法主要是DC治疗、CIK治疗和DC-CIK联合免疫治疗。DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC)，一方面，其能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答；另一方面，树突状细胞还能够呈递抗原给MHC-I类限制性CD8+和MHC-II类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为“天然免疫佐剂”，因此，树突状细胞在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年来，以树突状细胞(dendriticcell,DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前景。目前，从外周血单个核细胞(PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12，致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术培养出的树突状细胞体外诱导成熟率低，细胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一种能够提高树突状细胞成熟率及抗原提呈性能的树突状细胞的培养方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，每隔2～3天更换培养基，获得未成熟树突状细胞；再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；其中，第一诱导剂包括：rhGM-CSF和rhIL-4；第二诱导剂包括rhTNF-α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为800～1200U/ml和rhIL-4的浓度为800～1200U/ml。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为1000U/ml和rhIL-4的浓度为1000U/ml。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为800～1200U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为5～15μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为5～15μg/ml。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为1000U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为10μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为10μg/ml。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述番茄脂溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：避光条件下，取新鲜番茄处理成浆状后，干燥至粉末状；取番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混匀，离心，收集上清液，向残留物中添加正丁烷混匀，离心，再次收集上清液，然后将收集的上清液混合，用蒸馏水和NaCl溶液清洗后，用氮气吹干即可。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述番茄水溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：避光条件下，取新鲜番茄处理成浆状后，干燥至粉末状；取番茄粉末，加入乙醇，加热至40～70℃、1～2小时，冷却后离心；于相同条件下加热冷却离心并提取残渣两次，合并上清液，过滤备用。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，所述树突状细胞前体单个核细胞的获取过程，包括以下步骤：抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10～20分钟后，分离获取外周血单个核细胞；用含有10％～15％的胎牛血清、50～150U/ml青霉素和50～150U/ml链霉素的完全培养基悬浮细胞浓度至(2～6)×106个/ml，孵育1～3小时，更换新的完全培养基，收集细胞悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。在本专利技术提供的树突状细胞的培养方法中，还包括以下步骤：添加所述第一诱导剂之前，需调节所述树突状细胞前体单个核细胞浓度为(1～3)×106个/ml。本专利技术还提供一种树突状细胞，是由上述树突状细胞的培养方法所获得的。实施本专利技术提供的树突状细胞的培养方法，可以达到以下有益效果：与现有培养树突状细胞的方式相比，本专利技术通过第一诱导剂和第二诱导剂对树突状细胞进行两个阶段的诱导活化，并采用番茄脂溶性提取物或水溶性提取物作为第二诱导剂，能够促进提高树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈性。具体实施方式本专利技术提供的树突状细胞的培养方法，包括以下步骤：S1、获取树突状细胞前体单个核细胞；S2、采用第一诱导剂将树突状前体细胞当个核细胞诱导分化成未成熟树突状细胞；S3、采用第二诱导剂将未成熟树突状细胞诱导分化成成熟的树突状细胞。具体地，步骤S1中，优选地，树突状细胞前体单个核细胞来源于新鲜外周血，相比经过冷库储存或者培养传代之后的树突状细胞，从新鲜血液中制备的树突状细胞前体单个核细胞离体时间较短，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持其免疫性能。在本专利技术中，树突状细胞前体单个核细胞的具体获取过程为：抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10～20分钟后，分离获取外周血单个核细胞；用含有10％～15％的胎牛血清、50～150U/ml青霉素和50～150U/ml链霉素的完全培养基悬浮细胞浓度至(2～6)×106个/ml，孵育1～3小时，更换新的完全培养基，收集细胞悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。步骤S2的具体过程为：取步骤S1获得的树突状细胞前体单个核细胞悬液，离心洗涤后计数，使细胞浓度达到(1～3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种树突状细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，每隔2～3天更换培养基，获得未成熟树突状细胞；再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；其中，第一诱导剂包括：rhGM‑CSF和rhIL‑4；第二诱导剂包括rhTNF‑α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。

【技术特征摘要】
1.一种树突状细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4～7天，每隔2～3
天更换培养基，获得未成熟树突状细胞；
再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞至树突状细胞成熟；
其中，第一诱导剂包括：rhGM-CSF和rhIL-4；
第二诱导剂包括rhTNF-α和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。
2.根据权利要求1所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第
一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为800～1200U/ml、和rhIL-4的浓度为
800～1200U/ml。
3.根据权利要求2所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第
一诱导剂中，rhGM-CSF的浓度为1000U/ml和rhIL-4的浓度为1000U/
ml。
4.根据权利要求1所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第
二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为800～1200U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度
为5～15μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为5～15μg/ml。
5.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述第
二诱导剂中，rhTNF-α的浓度为1000U/ml和番茄脂溶性提取物的浓度为10
μg/ml，或番茄水溶性提取物的浓度为10μg/ml。
6.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，所述番
茄脂溶性提取物的提取方法，包括以下步骤：
避光条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44