一种树突状细胞疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种树突状细胞疫苗及其制备方法与应用。公开了一种制备针对肝癌干细胞的人树突状细胞(DC)癌症疫苗方法：用锌指核酸酶技术向肝癌细胞株基因组的AAVSl位点中插入Oct4和Sox2基因；采用肿瘤干细胞球体形成法，从修改过的肝癌细胞中富集了类肝癌干细胞；用类肝癌干细胞冻融裂解液刺激自体血分离制备的树突状细胞得负载肝癌干细胞抗原的抗原递呈DC细胞，建立的肝癌干细胞株能高水平地表达肝癌干细胞的分子标记物，显著提升CDl3、CD90和EpCAM等数个肝癌干细胞标记物的表达，特异性强；采用的抗原递呈树突状细胞源自自体血、安全性高，毒副作用小；制备DC细胞癌症疫苗经试用后显著激发肿瘤干细胞特异性细胞毒性效应CTL反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学生物工程
，具体涉及一种树突状细胞疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
肝癌(HCC)是一种原发性的肝脏恶性肿瘤，在全世界常见的癌症相关死因中名列第三。绝大多数肝细胞癌次发于病毒性感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或肝硬化(酒精中毒为肝硬化最常见的原因)。手术为治愈提供最大的可能，但是只有10-20％的肝癌能彻底被手术根除。很多不能进行肝癌(即HCC)手术或术后发生转移复发的病人会接受化/放疗。不幸的是，HCC是一种对常规化疗药剂抗药性很强的肿瘤，放疗也很少奏效。所以肝癌给个人、家庭和社会带来很大的负担。近十年来积累的科学证据显示在包括HCC在内的各种恶性肿瘤中，存在被称为癌症干细胞(CSC)或癌症起始细胞(CIC)的一种细胞亚群。CSC数量很少，却具备很强的肿瘤生成能力。CSC具有干细胞的特性，能进行自我更新并产生表型多样的肿瘤细胞群。这些肿瘤生成细胞对维持肿瘤生长和启动远距离转移起关键作用。在临床方面，CSC被认为是肿瘤对主要常规治疗方法(包括化疗和放疗)产生抗药性的主要原因。在对原发性肿瘤进行手术切除和放疗化疗后，肿瘤复发和转移的病例很常见。这有可能是因为手术及放化疗手段均未能成功地消灭CSC，而导致CSC再次催生恶性肿瘤。现有许多的肿瘤免疫疗法都是针对已分化的肿瘤细胞的抗原。这些抗原可能只是选择性的在分化的肿瘤细胞表达，CSC并不一定表达这些抗原，因此CSC能逃过这些免疫治<br>疗的捕杀。很多研究表明肿瘤干细胞是HCC生成、复发、和转移的主要原因，也是目前肝细胞癌治疗失败的主要原因。因此，采用以CSC为目标的治疗策略是阻止肿瘤转移和复发的关键手段。致癌性转化和通过重新编程所引导的多能干细胞(iPSC)衍生之间的高度相似性已在医学界引起一定的关注：即二者都可以被一系列的遗传和表观遗传修饰诱导和利用类似的基因调控网络。从体细胞分化为多能干细胞过程中，细胞获得无限增殖和自我更新的活动属性，这两个特点对于癌细胞来说是最重要的。事实上有研究表明，多能干细胞的基因表达谱与多种类型的肿瘤，以及它们在致癌性过程中的基因表达谱有共同之处，也就是说多能干细胞重编程与致癌性转化利用了一些共同机制。Oct4的异位表达可依赖剂量性地增加胚胎干细胞的恶性癌变潜能，足以诱导小鼠体内肿瘤细胞的形成。SOX2被确定为放大的宗族生存基因，它存在于肺和食管鳞状癌细胞中。多能性相关因子的表达增加通常会在分化状况差的肿瘤细胞中被检查出来。这表明了这些肿瘤细胞已经拥有了未分化过的干细胞特性。在临床上，亚型癌症的Oct4和Sox2表达的增加与侵袭性病程相关，如未分化的组织、抵抗治疗、转移、复发、缩短患者的生存率。因为这些相关性，这两种蛋白已被提议作为长时间后复发和患者预后出现不良状况的新预测。最近的直接证据表明Oct4和Sox2基因与癌干细胞有关。在来源相同的几种癌症中比较，这两种蛋白质在癌干细胞(CSCs)中的表达水平明显比在相对分化的癌症细胞高。在源自肺癌的CD133阳性细胞内，Oct4的表达是维持癌症干细胞特性的必须条件。在恶性胶质瘤中，抑制癌干细胞中的Sox2表达可减缓CSC细胞的增殖，及使其失去致癌性。在骨肉瘤里，一个肿瘤细胞亚群被证实能够激活外源性Oct4报告基因，而且比其它的亚群更容易衍生出由Oct4阳性和Oct4阴性细胞所构成致癌性更大的异质性肿瘤。在正常乳腺细胞中异位表达Oct4的可导致肿瘤细胞的形成，而且能在裸鼠中形成细胞分化度低、肿瘤分类等级高的乳腺癌乳腺癌。在上皮性卵巢癌，从原发肿瘤中分离的干细胞有较高的Oct4表达水平。在大肠癌细胞中，多能干细胞基因的异位表达可使细胞成型、增殖、克隆成型和人类大肠癌细胞迁移，而且癌症细胞中的多功能干细胞基因表达可以用于预测癌症患者的存活率。这些研究结果表明，一些多功能干细胞基因可以作为肿瘤干细胞诱导主要调节因子，以及维护肿瘤干细胞特性的关键因素。鉴于Oct4和Sox2在在致癌性细胞和癌干细胞中的高水平表达和高活性，但在正常组织中的表达有限，它们是免疫干预的潜在目标。考虑到临床观察发现Oct4、Sox2和很多其它CSC标记物的上调与HCC病人预后不良有关。但众所周知，肝癌干细胞在肝癌组织中所占的数量很少，而且从原发性肝肿瘤中分离出的肝癌干细胞在体外培养时会迅速分化为非肝癌干细胞。所以要获取充足的肝癌干细胞来制备针对肝癌干细胞的树突状细胞癌症疫苗是一个关键的技术瓶颈。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中肝癌干细胞在肝癌组织中所占的数量很少，特异性表达很弱的技术瓶颈，从而提供一种特异性强、能高水平地表达肝癌干细胞的分子标记物的肝癌干细胞株。为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗的制备使用Oct4和Sox2基因高表达的肝癌细胞株.Oct4和Sox2基因高表达是通过在肝癌细胞株基因组的AAVS1位点中特异性插入这俩个基因来取得的。进一步的，所述的制备树突状细胞疫苗的肝癌细胞株中，所述AAVS1位点位于基因编码的蛋白磷酸酶1调节亚基内，调节位于人类基因组的19号染色体亚基12C，即ppp1r12c上；是非致病性腺相关病毒的特异性结合位点2型。优选的，所述的制备树突状细胞疫苗的肝癌细胞株中，所述Oct4基因序列长度为1080；所述Sox2基因序列长度为951。优选的，所述的树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗将肝癌干细胞通过细胞诱导技术诱导扩增而来。更为优选的，所述的树突状细胞疫苗，所述肝癌干细胞是由修改后的肝癌细胞，通过肿瘤干细胞球体形成法富集而来。本专利技术还公开了一种制备所述的疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：(1)采用杆状病毒-锌指核酸酶技术向肝癌干细胞株基因组的AAVS1位点中插入Oct4和Sox2基因，制备得到修改后的肝癌细胞；(2)对所述的修改后的肝癌细胞，采用肿瘤干细胞球体形成法富集类肝癌干细胞，提升肝癌干细胞标记物的表达；(3)由自体血分离制备单核细胞，加入细胞因子诱导扩增抗原递呈树突状细胞，然后用类肝癌干细胞冻融裂解液刺激树突状细胞以获得负载肝癌干细胞抗原的抗原递呈树突状细胞。本专利技术还公开了任一所述疫苗和所述方法在肝癌免疫领域的应用。本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：(1)本申请采用锌指核酸酶技术向HCC细胞基因组中插入了Oct4和Sox2基因，从基因上改变这些癌细胞，促使非肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的制备使用Oct4和Sox2基因高表达的肝癌细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的制备使用
Oct4和Sox2基因高表达的肝癌细胞株。
2.如权利要求1所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述制备疫苗的
肝癌细胞株基因组的AAVS1位点中插入了Oct4和Sox2基因。
3.如权利要求2所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述肝癌细胞株
AAVS1位点位于基因编码的蛋白磷酸酶1调节亚基内，调节位于人类基因组的
19号染色体亚基12C，即ppp1r12c上；是非致病性腺相关病毒的特异性结合
位点2型。
4.如权利要求2所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述插入肝癌细
胞株AAVS1位点中的Oct4基因序列长度为1080；所述Sox2基因序列长度为
951。
5.如权利要求1所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞
疫苗将肝癌干细胞通过细胞诱导技术诱导扩增而来。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓朗，王晖，王柯，
申请(专利权)人：深圳市科晖瑞生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44