本发明专利技术公开了重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用。本发明专利技术提供了一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物。本发明专利技术所提供用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。本发明专利技术所提供的重组肠道病毒71型病毒样颗粒(VLP)在形态上和真实的病毒类似并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以为抗病毒疫苗的开发提供了理想的备选方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用。
技术介绍
手足口病(Hand foot moth disease, HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由人肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus) A组16、4、5、7、9、10型,B组2、5型；埃可病毒(ECHOviruses)和肠道病毒71型(EV 71)感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最为常见。EV71感染引起的手足口病大部分病例病情较轻，可自愈，但少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎和肺水肿等并发症，严重时可危及生命。在我国从上世纪80年代以来，北京、河北、天津、福建、山东、广东等十几个省(市)都曾有发生手足口病的报道。2000年5 8月山东省招远市小儿手足口病暴发，仅市人民医院就接诊患儿1698例。2007年，全国共报告手 足口病病例83，344例，死亡17例，仅山东省就报告了手足口病病例39，606例。2008年I月I日至5月12日，北京市累计报告手足口病病例3606例。2009年手足口病流行情况在我国进一步扩大，除西藏外，全国30个省份均有手足口病例发生。全国当年累计报告手足口病例115万余例，重症13810例，死亡353例，高峰期每天新增感染4000例。2010年手足口病再次疯狂来袭，全国就累计感染病例180万例，死亡近900余例。发病率和死亡率均较2009年同期有较大增高。因此，研制EV71预防性疫苗对于控制婴幼儿手足口病的流行具有重要意义。肠道病毒71型(EV71)属小RNA病毒，病毒基因组为约7kb的单链RNA，病毒颗粒直径约为20-30nm，由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成。研究显示，EV71结构蛋白可自我组装形成病毒样颗粒结构(Virus-Like Particle, VLP),具有与天然病毒颗粒相似的空间结构。EV71 VLP免疫小鼠可产生具有保护效力的中和抗体，可显著提高攻毒试验中实验动物的存活率(Wu CN, Lin YC, Fann C, Liao NS, Shih SR, Ho MS. Protection againstlethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization withinactivated virus and subunit VPl vaccine. Vaccine 2001 ;20 :895-904.),是很有前景的预防婴幼儿手足口病候选疫苗。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物。本专利技术所提供的用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。含有所述DNA分子组合物的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种制备重组病毒样颗粒的方法。本专利技术所提供的制备重组病毒样颗粒的方法，包括以下步骤将所述DNA分子组合物导入宿主菌得到重组菌，从所述重组菌中分离纯化得到重组病毒样颗粒。所述宿主菌为酵母菌；所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。所述DNA分子组合物是通过重组表达载体导入宿主菌的。所述重组表达载体为如下I)和2)所示I)将所述DNA分子组合物中的DNA分子I插入表达载体pESC_HIS的多克隆位点之间得到中间重组表达载体I ;将所述DNA分子组合物中的DNA分子IV插入所述中间重组表达载体I的多克隆位点之间得到的重组表达载体； 2)将所述DNA分子组合物中的DNA分子III插入表达载体pESC_URA的多克隆位点之间得到中间重组表达载体II ;将所述DNA分子组合物中的DNA分子II插入所述中间重组表达载体II的多克隆位点之间得到的重组表达载体。根据所述方法制备得到的重组病毒样颗粒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的又一个目的是提供一种疫苗。本专利技术所提供的疫苗，其活性成分为所述重组病毒样颗粒。所述的重组病毒样颗粒在制备疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述疫苗为预防肠道病毒感染的疫苗。本专利技术提供了编码EV71 VP1、VP2、VP3和VP4病毒蛋白质的合成DNA分子。设计合成分子的密码子使用酵母细胞优选的密码子予以提高在酵母细胞培养环境中的蛋白质表达水平。在本专利技术中，将EV71病毒编码的VP1、VP2、VP3和VP4基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有酵母优选密码子的优化序列。最佳密码子的优选和替换对在特定宿主中高水平表达外源基因具有重要意义。在酵母中表达EV71病毒样颗粒的优点在于成本和工艺效能合算，酵母适合于在发酵罐中大规模生长培养。本专利技术的EV71 VP1、VP2、VP3和VP4基因序列除经过密码子优化改造外还不含有酵母识别的内部转录终止信号。本专利技术的EV71 VP1、VP2、VP3和VP4的合成基因序列用编码相同氨基酸的酵母高利用率的密码子替换了不适合在酵母表大中应用的EV71 ￥ 1、￥ 2、￥ 3和￥ 4基因的野生型序列，以完成在酵母中的高表达。本专利技术利用酵母系统共表达EV71基因优化的VP1、VP2、VP3和VP4的合成基因制备EV71病毒样颗粒。本专利技术所提供的重组肠道病毒71型病毒样颗粒(VLP)在形态上和真实的病毒类似并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以为抗病毒疫苗的开发提供了理想的备选方案。附图说明图I为Western Blot鉴定重组EV71衣壳蛋白VPl的表达；其中泳道A为蛋白分子量标准；泳道8为共转化pESC-VPl-VP4和pESC_VP3_VP2酵母蛋白提取物；泳道(为共转化pESC-URA和pESC-HIS酵母蛋白提取物。图2为显示了通过透射电镜技术显现的本文中描述的EV71病毒样颗粒(VLPs)的代表样品；图中白色横线代表50纳米。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、制备重组肠道病毒71型病毒样颗粒一、多肽VP1、VP2、VP3和VP4编码基因的优化1.EV71 VP1、VP2、VP3和VP4编码基因的密码子优化在不改变蛋白氨基酸序列的前提下将野生型肠道病毒EV71的VP1、VP2、VP3和VP4蛋白编码基因的密码子替换为酵母细胞高频使用的密码子(见表1)，对序列进行修正，突变不需要的酶切位点及影响或终止蛋白表达的位点。 表I酵母中的密码子应用高频表 TTTF 0.59TCT S 0.26TAT Y 0.56TGT C 0.63 TTCF 0.41TCC S 0.16TAC Y 0.44TGC C 0.37 TTA L 0.28TCA S 0.21TAA X 0.47TGA X 0.31 TTG L 0.28TCG S 0.10TAG X 0.22TGGW 1.00CTT L 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列I所不；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。2.含有权利要求I所述DNA分子组合物的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。3.一种制备重组病毒样颗粒的方法，包括以下步骤 将权利要求I所述的DNA分子组合物导入宿主菌得到重组菌，从所述重组菌中分离纯化得到重组病毒样颗粒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 所述宿主菌为酵母菌； 所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于 所述DNA分子组合物是通过重组表达载体导入宿主菌的...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙新，杨志平，
申请(专利权)人：北华大学，吉林省中轩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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