用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是用于扩增肠道病毒71型时用到的一套优化的工艺方法。该方法以聚纤维纸片为载体利用生物反应器扩增非洲绿猴肾细胞，从而建立肠道病毒71型复制扩增的全套工艺流程。本方法建立在对肠道病毒71型复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，在病毒接种吸附后至24小时使用带3-5%的血清DMEM培养基，在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.5%的水解乳蛋白，同时每24小时补充2g/L的葡萄糖，该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。具有良好重复性、高效肠道病毒71型扩增工艺，可适用于任何以聚纤维纸片为载体的生物反应器扩增肠道病毒71型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是用于扩增肠道病毒71型(EV71)的一套全面优化的工艺方法。
技术介绍
肠道病毒71型(EV71)是手足口病的重要病原体之一，由EV71感染引起的手足口病并发症较为严重，死亡率相对较高，因此研发EV71病毒相关疫苗是目前预防手足口病的研究热点.目前绿猴肾(Vero)细胞的大规模培养技术相对比较成熟，但在培养EV71病毒方面报导较少，目前有用Cytodexl作为载体培养EV71取得一定进展,但在聚纤维纸片(Fibradisk)载体上尚未报导。要完善这个工艺首先必须建立在对VERO细胞生理和生长特性的全面认识，以及对EV71感染细胞后的复制机理有全面把握。首先，细胞感染病毒前后会发生各种变化，如细胞干重、蛋白和核酸(DNA)含量、细胞大小都有不同程度的增加，Vero在不含血清的培养基中，Vero细胞感染病毒后直径扩大20%左右。在感染24，48小时后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了 30%- 100%，氧气(O2 )消耗和三磷酸腺苷(ATP)的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量。因此在培养病毒阶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于该方法以聚纤维纸片为载体,利用生物反应器扩增非洲绿猴肾细胞，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，培养细胞第六天换液成无血清培养基，吸附肠道病毒71型病毒2.5?3.5小时，加入3?5%胎牛血清，继续培养22小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止再吸附1.5?2.5小时利于更多细胞均匀感染病毒，接种病毒后每24小时添加2g/L的葡萄糖,使优化工艺达到较高的病毒滴度。

【技术特征摘要】
1.一种用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于该方法以聚纤维纸片为载体，利用生物反应器扩增非洲绿猴肾细胞，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，培养细胞第六天换液成无血清培养基，吸附肠道病毒71型病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养22小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时利于更多细胞均匀感染病毒，接种病毒后每24小时添加2g/L的葡萄糖，使优化工艺达到较高的病毒滴度。2.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于具有如下步骤:1)在生物反应器内加入生长液，接种绿猴肾VERO细胞，批次换液培养5-6天，密度达到6 X IO6个/ml以上，接种肠道病毒71型，34°C静止吸附2.5-3.5小时，连续培养扩增病毒 ，每24小时左右批次换液收获；(2) 72-96小时后，细胞每日葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈科达，姜云水，高丽美，王一虎，周康凤，朱莲，王平，毛子安，高孟，毛江森，
申请(专利权)人：浙江普康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：