本发明专利技术公开了一种洋葱腐烂病菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株。本发明专利技术提供的一种保藏号为CGMCC?No.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2。还提供了一种洋葱腐烂病菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC?No.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2产生。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术研制的洋葱腐烂病菌单克隆抗体的特异性好、效价高，具有较好的广谱性，可应用于植物病毒血清学诊断试剂中，特异性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种洋葱腐烂病菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株。
技术介绍
洋葱腐烂病菌(Burkholderia gladioli pv.alliicola)在分类上属于原核生物界(Procaryoces)薄壁菌门(Gracilicutes)肠杆菌科(Enterobacteriaceae)伯克霍尔德菌属(Burkholderia)唐菖蒲伯克霍尔德种(Burkholderia gladioli)洋葱腐烂病致病变种，是我国的检疫性有害生物。该病菌侵染洋葱由叶片侵染至球茎，后期肉质鳞状组织出现水浸状，逐渐腐烂变软，在病害发病后期可看到大量细菌分泌物，并有粘性、腐烂难闻液体流出，直至整个球茎变干、枯萎。洋葱腐烂病菌田间发病率可达到89.1%，传播途径包括带菌种子、鳞球茎、土壤等。目前该菌的检测方法主要包括病原形态及生理生化鉴定方法和分子生物学方法
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种洋葱腐烂病菌的单克隆抗体及应用。本专利技术提供了一种保藏号为CGMCC N0.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2。本专利技术还提供了一种洋葱腐烂病菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC N0.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2产生。上述的单克隆抗体在检测洋葱腐烂病菌中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的单克隆抗体在制备洋葱腐烂病菌检测试剂盒中的应用；或上述的单克隆抗体在制备检测洋葱腐烂病菌的胶体金快速检测试纸条中的应用，上述应用均是本专利技术保护的范围。含有上述的单克隆抗体的检测洋葱腐烂病菌的试剂盒也是本专利技术保护的范围；或含有上述的单克隆抗体的检测洋葱腐烂病菌的胶体金快速检测试纸条也是本专利技术保护的范围。经筛选得到能稳定分泌洋葱腐烂病菌单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2，该杂交瘤细胞株3B2的分类命名为分泌洋葱腐烂病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2013年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.7455。本专利技术的实验证明，本专利技术研制的单克隆抗体用于检测洋葱腐烂病菌，具有特异性好、效价高，广谱性等优点。本专利技术提供的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体可以应用于洋葱腐烂病菌免疫学诊断试剂，且单克隆抗体由于其是针对单一抗原决定簇产生的，所以具有特异性好的优势，为该病菌免疫学方法的应用奠定了基础。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的病菌和试剂如下:洋葱腐烂病菌(Burkholderiagladioli pv.alliicola)NCPPB947、绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava) ATCC13222> 桃红欧文氏菌(Erwinia persicinus)NCPPB3375、须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)ATCC23060、番爺溃瘍病菌(Clavibacter michiganense subsp.michiganense)ATCC14456、胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种(Pectobacterium betavasculorum)NCPPB2793 和泛生菌(Pantoea agglomerans)ATCC13329。碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠酶标抗体购自购自victor,货号:AP_2000。包被缓冲液、样品抽提缓冲液、酶标抗体稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液配方如下；每I升包被缓冲液按照如下方法配制:将碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g和叠氮化钠0.20g溶于水，用水定容至IL ;包被缓冲液的pH值为9.6 ;每I升洗涤缓冲·液(PBST)按照如下方法配制:将氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钾0.2g，吐温200.5mL，叠氮化钠0.2g溶于水中，用水定容至IL ;所述洗涤缓冲液的PH值为7.4 ;每I升样品抽提缓冲液按照如下方法配制:将亚硫酸钠1.3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于PBST中，用PBST缓冲液定容至IL ；每I升酶标抗体稀释缓冲液按照如下方法配制:将聚乙烯基吡咯烷酮20g和牛血清白蛋白2g溶于洗涤缓冲液中，用洗涤缓冲液定容至IL ；每I升底物溶液按照如下方法配制:将二乙醇胺97mL和对硝基苯磷酸二钠(现配现用)Ig溶于水中，调节PH值至9.8，然后用水定容至1L。实施例1、洋葱腐烂病菌的单克隆抗体的制备和生物学特性的测定一、洋葱腐烂病菌的单克隆抗体的制备1、洋葱腐烂病菌的制备将洋葱腐烂病菌(Burkholderiagladioli pv.alliicola)NCPPB947 划线培养至NA培养基上，26°C培养48h后，挑取单菌落接种于NB培养基26°C震荡培养，浓度达到IO8个/ml后,取IOml IOOOOg离心IOmin,无菌水洗漆沉淀,然后悬浮沉淀,洗漆3次,最后溶于500ul无菌水中，得到浓度为IX IO9个/ml的洋葱腐烂病菌悬浮液。2、小鼠免疫稀释上述浓度为IXlO9个/ml的洋葱腐烂病菌悬浮液与其同体积的弗氏完全佐剂中乳化，得到乳化产物，将乳化产物对8周龄的BALB/c小鼠做腹腔注射，每只小鼠使用IXlO8个纯化的洋葱腐烂病菌，注射量为0.3ml乳化产物。2周后，将乳化产物与其同体积的弗氏不完全佐剂中乳化做第二次腹腔注射，每只小鼠使用IX IO8个纯化的洋葱腐烂病菌，注射量为0.3ml乳化产物。2周后第三次免疫小鼠(同第二次)。融合前3d加强免疫，力口强免疫是采用I X IO8个洋葱腐烂病菌直接注射小鼠腹腔，注射量为0.3ml洋葱腐烂病菌悬浮液，得到免疫小鼠。3、杂交瘤细胞的筛选将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，得到融合细胞。用洋葱腐烂病菌以IXlO7个/ml的浓度包被酶标板(每孔100 μ L)，采用间接ELISA进行测定融合细胞上清液效价，一抗为融合细胞上清液，二抗为碱性磷酸酶标记的马抗小鼠抗体。对阳性孔的细胞用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100%，阳性克隆细胞及时冻存。经间接ELISA法筛选，3次亚克隆化获得了 I株能稳定分泌洋葱腐烂病菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经筛选得到能稳定分泌洋葱腐烂病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3Β2，该杂交瘤细胞株3Β2的分类命名为分泌洋葱腐烂病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2013年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCN0.7455。4、单克隆抗体的制备将上述筛选得到的杂交瘤细胞株3B2CGMCC N0.7455置于细胞培养基(含体积百分含量为20%的胎牛血清的DMEM培养基)中，放置在二氧化碳培养箱中培养72小时(96小时)，得到3Β2培养上清，即为洋葱腐烂病菌单克隆抗体。杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:10000。DMEM培养基，购自ATCC，货号30-2002 ;上述培养时间3天，培养条件:温度37°C，二氧化碳本文档来自技高网...
【技术保护点】
保藏号为CGMCC?No.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2。
【技术特征摘要】
1.保藏号为CGMCCN0.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2。2.由权利要求1所述的保藏号为CGMCCN0.7455的洋葱腐烂病菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B2产生的单克隆抗体。3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备洋葱腐烂病...
【专利技术属性】
技术研发人员：周琦，梁新苗，李桂芬，邓丛良，赵文军，李建光，汪万春，马洁，边勇，程琳，吕玉峰，郑春生，骆卫峰，刘若思，张丽杰，高文娜，江丽辉，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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