一种小鼠抗人PCNA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为12D10，保减编号为：CGMCC?No.6914。本发明专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株12D10产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ?ID?NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ?ID?NO：10。本发明专利技术还提供了一种DNA分子SEQ?ID?NO：7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ?ID?NO：9；一种DNA分子SEQ?ID?NO：8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ?ID?NO：10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测PCNA表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以原核表达的PCNA蛋白免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株12D10，属于生物工程
技术介绍
增殖细胞核抗原(ProliferatingCell Nuclear Antigen 简称 PCNA)又称周期蛋白，是一种分子量为36kDa的酸性蛋白，于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中被首次发现并命名。PCNA是一种核内蛋白质,在细胞核内合成,并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，是DNA合成必不可少的因子。PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的辅酶，具有协调DNA复制、调控细胞周期等多种生物学功能，在调节DNA合成和细胞增殖方面起着重要作用。增殖旺盛的细胞中，PCNA呈强阳性表达，而在静止期细胞中为阴性表达，其合成量与细胞增殖状态成正相关。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化；不溶性PCNA较稳定，在GO Gl期细胞中无明显表达，在细胞Gl期开始升高，于S期达到峰值，G2 M期明显下降，M期降至最低点，其量的变与DNA的合成量曲线相一致。检测PCNA在细胞中的表达,可作为评价细胞增殖状态的一个指标,是细胞增殖的理想标记物。PCNA免疫染色基本完全着色于细胞核上，表现为弥散的或(和)颗粒的形式。PCNA能在增殖细胞中合成和表达，因而PCNA不仅存在于肿瘤组织中，也存在于正常的可增殖组织中，如上皮组织、淋巴组织等。肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。国内外许多学者对肿瘤进行了 PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性。有研究发现，PCNA指数在原位癌组织中明显增高，与癌前病变组织和正常组织比较，存在明显差异。这对判断癌前病变和原位癌有重要意义，可提高肿瘤的早期诊断率。在乳腺癌、肺癌组织中，PCNA被认为是判断预后的可靠指标，PCNA表达高者死亡率高、预后差。检测PCNA是一种比较理想的判断细胞增生的指标，对肿瘤的早期诊断、指导肿瘤的治疗、对肿瘤预后的判断等方面会有越来越广泛的用途。目前，国内外已经获得了多种PCNA的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高， 具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的PCNA的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测PCNA表达的小鼠抗人PCNA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案:(I)根据PCNA的基因序列(ΝΜ_002592.2)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增PCNA基因，构建重组表达载体PET28a-PCNA，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备PCNA单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)采用免疫印迹法(Western blot)检测PCNA单抗的特异性，通过免疫组织化学分析PCNA单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体PCNA重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体PCNA的重链和轻链可变区序列。本专利技术提供的以原核表达的PCNA蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为12D10，分类命名为小鼠抗人PCNA杂交瘤细胞系，该细胞株12D10已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCN0.6914。本专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株12D10，CGMCC N0.6914产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO =IO0本专利技术还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本专利技术的优点和有益效果:本专利技术应用重组人的PCNA蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗PCNA的杂交瘤细胞株，命名为12D10，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对PCNA单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上。免疫印迹法(Western blot)检测PCNA单抗的效价及特异性，结果显示在分子量36KDa处有一条明显的区带，证明是抗PCNA小鼠单克隆抗体，梯度稀释显示抗体1: 2000稀释后条带依然清晰；乳腺癌石蜡切片经抗PCNA抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到呈均匀着色的棕黄色颗粒，定位在细胞核，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本专利技术制备了高效价，高特异性的PCNA单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的PCNA蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测PCNA表达。附图说明图1SDS-PAGE分析纯化后的PCNA单克隆抗体。 图2ELISA法测定PCNA单克隆抗体滴度。图3是免疫印迹法(Western blot)检测PCNA单抗的纯度及特异性。图4是免疫组织化学检测分析PCNA单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1:杂交瘤细胞株12D IO及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备(I)获得目的基因在该实施例中，根据PCNA的基因序列(NM_002592.2)的编码框，设计I对特异引物:引物1:5' -TAGGATCCATGTTCGAGGCGCGCCTGG-3' (SEQIDN0:1)引物2:5' -ACTCGAGCTATGATCCTTCTTCATCC-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增PCNA基因。 (2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-PCNA。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以原核表达的PCNA蛋白免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株12D10，保藏编号为CGMCC?No.6914。
【技术特征摘要】
1.一种以原核表达的PCNA蛋白免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株12D10，保藏编号为 CGMCC N0.6914。2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株12D10产生的单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为S...
【专利技术属性】
技术研发人员：张林刚，郗日沫，尹芝南，
申请(专利权)人：天津三箭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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