维生素B1的偶联物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种通式（I）的维生素B1（硫胺素）的偶联物，由维生素B1与产生免疫原性的载体物质优选牛血清蛋白或血蓝蛋白偶联构成，其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B1的分子数，n为整数1~20，BSA为牛血清蛋白，分子量范围为6.6KDa~6.9KDa。本发明专利技术还公开了所述的偶联物的制备方法，即将维生素B1与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。制备了效价达到1:3200的抗血清，其最低检测限为0.18ppm。本发明专利技术具有简便，快捷，特异，准确的特点，为制备维生素B1的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。（I）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设计一种水溶性维生素的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及一种维生素B1的偶联物及其制备方法与应用。属维生素免疫检测领域。
技术介绍
本专利技术涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：BSA：牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin），Sigma公司产品。维生素B1：硫胺素，Sigma公司产品。EDC：乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺，简称EDC，Sigma公司产品。PBS：磷酸缓冲液（Phosphatebuffersaline）（0.01M，pH7.4）。包被液：coatingbuffer（0.01M，pH9.5）。透析膜：北京索莱宝科技公司产品。维生素B1属于水溶性维生素，补充维生素B1可以促进儿童成长，帮助碳水化合物的消化，维持神经组织、肌肉、心脏活动的正常等。维生素B1是人体能量代谢，特别是糖代谢所必需的，故人体对硫胺的需要量通常与摄取的热量有关。当人体的能量主要来源于糖类时，维生素B1的需要量最大。维生素B1还是维持心脏，神经及消化系统正常功能所必需的。当维生素B1缺乏时，按其程度，依次可出现下列反应：神经系统反应（干性脚气病），心血管系统反应（湿性脚气病）Wernicke（韦尼克氏）脑病及Korsakoff综合症（多神经炎性精神病）。许多神经体症和症状是周围神经炎，伴有肢端感觉障碍，包括局部区域感觉过敏或感觉麻木。心血管症状包括劳动时呼吸困难，心悸，心动过速和其他心电图不正常的情况，以及高输出量型心力衰竭。这种衰竭称为“湿性脚病”。它伴有广泛的水肿。因此，研究维生素B1在食品药品中的含量和检测方法是非常必要的。在维生素含量测定中，仪器法如高效液相色谱、液相质谱连用及微生物法是应用最广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且需要专业技术人员，需要大型仪器设备，并有可能造成有机溶剂污染，所以难于用于现场操作。酶联免疫检测法（ELISA）提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，灵敏，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA成为一种理想的，可用于物免疫常规扫描的检测方法。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。大多数维生素包括维生素B1都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，必须把这些化合物转变成能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原（又称之为完全抗原）。经检索，现在世界上尚未有关于维生素B1的免疫原的合成及抗体制备的报道，而且目前国内检测维生素B1的方法主要局限于液相色谱法，因此研究维生素B1的免疫原的合成及抗体制备就显得十分必要。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系统针对维生素B1有特异性反应的抗体的免疫原，即维生素B1的偶联物以及制备这种免疫原的方法。本专利技术的维生素B1的偶联物，由维生素B1半抗原与产生抗原性的载体物质偶联构成，所述载体物质为优选蛋白质，蛋白质片段，合成多肽或半合成多肽。上述的维生素B1的偶联物，其中所述的蛋白质优选是牛血清蛋白。本专利技术所述的维生素B1的偶联物，其结构通式如（I）（I）其中：n：为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B1的分子数，n为整数1~20BSA为牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin），分子量范围是6.6KDa~6.9KDa上述偶联物显示出如下物化特征：（1）外观：紫红色粉末状固体（2）紫外吸收光谱：265nm。上述的维生素B1的偶联物，其中优选n为整数1~10，BSA分子量范围是6.7KDa~6.8KDa。上述的维生素B1的偶联物的制备方法是：将维生素B1与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。上述的维生素B1的偶联物的制备方法具体步骤如下：（1）溶液A的制备：将维生素B1与亚硝酸钠（NaNO2）以摩尔比为1：5~6溶解于300μL水中，用浓盐酸调节pH在1~2，冰浴避光反应1h，得溶液A，备用；（2）溶液B的制备：将溶液A滴入到0.05~0.1M的对氨基苯甲酸的水溶液中，用NaOH调节pH在9~10，在0~4℃条件下，反应4小时，得溶液B；（3）溶液C的制备：按维生素B1，羟基琥珀酰亚胺（NHS），乙基[3-(二甲胺基）丙基]碳二亚胺（EDC），以摩尔比1:2~8:5~15的比例，将NHS及EDC溶于包被缓冲液中，将溶液B与上述溶液混合，室温反应2小时，得到溶液C；（4）溶液D的配制：将BSA溶于pH为7.38~7.56，浓度为0.01M的磷酸缓冲液（PBS）中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；（5）将维生素B1与BSA的摩尔比为15~50：分别取溶液C和溶液D，在室温条件下，把溶液C逐滴加入到不断搅拌下的溶液D中，反应8~10h，得到溶液E；（6）溶液E用上述磷酸缓冲液搅拌透析70~80小时，之后更换用蒸馏水透析70~80小时，每6~8小时更换一次透析液，透析过程在0~4℃下进行。（7）冻干透析之后的溶液E，得到紫红色维生素B1的偶联物。在上述制备中，维生素B1与亚硝酸钠摩尔比优选为1：6。在上述制备中，对氨基苯甲酸的浓度优选为0.07M。在上述制备中，维生素B1与羟基琥珀酰亚胺、EDC摩尔比优选为1：5：10。在上述制备中，维生素B1与BSA的摩尔比优选为50:1。利用本专利技术的技术方案可以成功地把半抗原维生素B1与载体蛋白特别是牛血清白蛋白BSA偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的免疫原。利用此免疫原免疫新西兰大白兔可以得到对半抗原维生素B1有特异性反应的抗体，经ELISA鉴定，利用本专利技术所述的维生素B1的偶联物作为免疫原制备的维生素B1特异性反应抗体，其抗血清效价达到1：3200，其最低检测限为0.18ppm。这为该偶联物用于制备维生素B1的酶联免疫分析检测试剂提供了广阔的应用空间。在实际应用中，把制备的维生素B1的特异性抗体镀在微孔板中，就可以用来检验实际样品中维生素B1的含量。由于该方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、样品前处理简单、检测成本低的特点，所以可以用于实际样品的初步扫面检测之用。这样不但可以节省大量的检验时间，还可以用于现场操作，从而弥补了仪器法一起昂贵，前处理复杂，需要专门的技术人员操作，难于用于现场的不足。所以，半抗原维生素B1与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联物的合成为这种快速检验法奠定了基础。具体实施方式实施例1（1）溶液A的制备：在5ml圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟），加入维生素B117.358mg（0.05mmol），亚硝酸钠20.00mg，溶于300μL蒸馏水中。加入200μL浓盐酸，调节pH在1~2之间。在冰浴条件下，避光反应1小时，得到黄色溶液；（2）溶液B的制备：在10ml圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟），加入对氨基苯甲酸10.00mg（0.07mmol），溶于1000μL蒸馏水中，将溶液A滴入到其中，并用1M的NaOH调节pH在9~10之间，在0~4℃条件下，反应4小时，得到紫红色溶液；（3）溶液C的制备：在10ml圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟），加入羟基琥珀酰亚胺（NHS）29.62mg（0.25mmol），乙基[本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维生素B1的偶联物，由维生素B1半抗原与产生免疫原性的载体蛋白牛血清蛋白或血蓝蛋白偶联构成。

【技术特征摘要】
1.一种维生素B1的偶联物，由维生素B1半抗原与产生免疫原性的载体蛋白牛血清蛋白或血蓝蛋白偶联构成。2.如权利要求1所述的维生素B1的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质是牛血清蛋白。3.如权利要求2所述的维生素B1的偶联物，其结构通式如（I）（I）其中：n：为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B1的分子个数，所述n为整数1~20，BSA为牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin），分子量范围是6.6KDa~6.9KDa；上述偶联物显示出如下物化特征：外观：紫红色粉末状固体紫外吸收光谱：265nm。4.如权利要求3所述的维生素B1的偶联物，其特征是：所述n为整数1~10，BSA分子量范围是6.7KDa~6.8KDa。5.如权利要求1~4中任一项所述的维生素B1的偶联物的制备方法，其特征是：将维生素与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。6.如权利要求5所述的维生素B1的偶联物的制备方法，由如下步骤完成：（1）溶液A的制备：将维生素B1与亚硝酸钠（NaNO2）以摩尔比为1：5~6溶解于300μL水中，用浓盐酸调节pH在1~2，冰浴避光反应1h，得溶液A，备用；（2）溶液B的制备：将溶液A滴入到0.05~0.1M的对氨基苯甲酸的水溶液中，用NaOH调节pH在9~10，在0~4℃条件下，反应4小时，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：郗日沫，董亚庆，尹永梅，孟萌，张丽沙，李小刚，宋兆瑞，王玉芬，龙浩，许昆，
申请(专利权)人：天津三箭生物技术有限公司，南开大学，李小刚，
类型：发明
国别省市：天津;12