一种小鼠抗人CK19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为11F5，保藏编号为CGMCC?No.6913。本发明专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株11F5产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ?ID?NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ?ID?NO：10。本发明专利技术还提供了一种DNA分子SEQ?ID?NO：7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ?IDNO：9；一种DNA分子SEQ?ID?NO：8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ?ID?NO：10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以原核表达的CK19蛋白免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株11F5，属于生物工程
技术介绍
CK即细胞角蛋白(Cytokeratin)，是细胞骨架蛋白之一中间丝多基因家族中的一种，为上皮细胞主要的结构蛋白和分化的早期标志物。细胞角蛋白由30种不同的基因编码，这些基因可以转录成分子量不同的20种多肽，分别命名为CKl CK20。细胞角蛋白又可根据等电点的不同分为酸性(I类)蛋白，包括CK9 CK20;及碱性(II类)蛋白，包括CKl CK8。一般而言，相对分子质量小的细胞角蛋白总是与大的细胞角蛋白配对，而酸性细胞角蛋白总是与碱性细胞角蛋白配对。细胞分化的不同阶段及不同类型上皮细胞表达不同的细胞角蛋白。CK19属于酸性(I类)细胞角蛋白，分子量约40kDa，是相对分子质量最小的细胞角蛋白，存在于正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，特别是单层上皮细胞和间皮；在肝细胞和角膜为阴性表达，在子宫上皮、羊膜的上皮和间质中呈阳性表达。CK19在肝细胞中不表达但存在于胆管上皮和胆管癌，由于这一特性，CK19是目前诊断肝内胆管细胞癌(ICC)的主要免疫组化标志物。作为上皮源性细胞特异性标志基因，CK19也是早期癌症微转移研究中运用最多的分子标志之一，主要用于腺癌的诊断以及转移性腺癌和肝癌的鉴别诊断。目前，国内外已经获得了多种CK19的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好， 稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的CK19的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达的小鼠抗人CK19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案:(I)根据CK19的基因序列(BC002539.2)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CK19基因，构建重组表达载体PET28a-CK19，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备CK19单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)通过免疫组织化学分析CK19单克隆抗体染色人甲状腺乳头状癌、结肠腺癌和肝脏胆管组织石蜡切片。(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CK19重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体CK19的重链和轻链可变区序列。本专利技术提供的以原核表达的CK19蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为11F5，分类命名为小鼠抗人CK19杂交瘤细胞系，该细胞株11F5已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCN0.6913。本专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株11F5，CGMCC N0.6913产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO =IO0本专利技术还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本专利技术的优点和有益效果:本专利技术应用重组人的CK19蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗CK19的杂交瘤细胞株，命名为11F5，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对CK19单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上。人甲状腺乳头状癌、结肠腺癌和肝脏胆管组织石蜡切片经抗CK19抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内出现呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本专利技术制备了高效价，高特异性的CK19单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的CK19蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达。附图说明图1SDS-PAGE分析纯化后的CK19单克隆抗体。图2ELISA法测定CK19单克隆抗体滴度。图3是免疫组织化学检测分析CK19单克隆抗体染色人甲状腺乳头状癌石蜡切片。图4是免疫组织化学检测分析CK19单克隆抗体染色人结肠腺癌石蜡切片。图5是免疫组织化学检测分析CK19单克隆抗体染色人肝脏胆管组织石蜡切片。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1:杂交瘤细胞株11F5及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备(I)获得目的基因在该实施例中， 根据CK19的基因序列(BC002539.2)的编码框，设计I对特异引物:引物1:5' -GGATCCATGACTTCCTACAGCTATCGCC-3' (SEQ ID NO:1)引物2:5' -CTCGAGTCAGAGGACCTTGGAGGCAG-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CK19基因。(2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-CK19。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(4)诱导表达和蛋白纯化将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，370C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化CK19蛋白。2、单抗的制备和纯化(I)、免疫动物—般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白CK19 (用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100 μ g/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白CK19(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白CK19 (用适量生理盐水稀释)，不本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以原核表达的CK19蛋白免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株11F5，保藏编号为CGMCC?No.6913。
【技术特征摘要】
1.一种以原核表达的CK19蛋白免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株11F5，保藏编号为 CGMCC N0.6913。2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株11F5产生的单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：张林刚，郗日沫，尹芝南，
申请(专利权)人：天津三箭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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