杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条制造技术

本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条。杂交瘤细胞株AFB3G1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC?NO.C201015。其分泌产生的单克隆抗体可识别黄曲霉毒素B1，灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为86pg/mL。由其获得的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条用于黄曲霉毒素B1含量的测定，可实现对黄曲霉毒素B1高、中、低三个浓度的半定量化检测，操作简单快速，灵敏度高，对检测溶液中黄曲霉毒素B1含量的最低检测限可达0.03ng/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条。
技术介绍
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素BI (AFBl)的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。历史上发生过很多AFBl污染食物链引发的人类中毒事件。奶牛摄入了 AFBl污染了的谷物后，经体内代谢后形成另一种致癌物质黄曲霉毒素Ml (AFMl) ,AFMl进入牛奶中则会严重威胁人类健康。另外，AFBl还能污染多种原料，包括水果、干果、蔬菜、调味品、油料作物、烟草及中草药等，由此可见=AFBl对食物链的污染极其广泛，几乎在食物链的每个环节都能发现存在。除此，在热带和亚热带地区农产品和食品中AFBl的检出率更高，污染更严重，花生、玉米和花生油等粮油食品污染最为严重，同时，AFBl超标而导致的农产品国际贸易纠纷事件也时常发生，1999年、2000年、2001年我国出口欧盟的花生到岸后，40%以上被欧盟检出黄曲霉毒素总量和AFBl分量超标，遭到退货或被迫转口贸易，致使我国农产品进出口贸易蒙受巨大损失，影响了我国农产品国际市场声誉。因此，加强花生等农产品及制品中AFBl的检测、特别是速测，及时了解和掌握农产品中AFBl的污染情况对保障我国食品消费安全具有重要意义。现有的黄曲霉毒素检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是黄曲霉毒素检测最常用的检测方法，该方法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可开展，但存在试剂消耗量大、操作繁琐、结果易受干扰、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大等不足，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法等，这些方法灵敏度高，检测结果准确，但所需的仪器设备昂贵，样品前处 理过程繁琐，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，检测过程耗时，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近年来发展起来的用于黄曲霉毒素检测的免疫分析技术克服了前两者的一些缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、检测成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小等优点，适于现场批量检测等。其中基于纳米金的免疫层析快速检测技术具有简便、快速、灵敏、适于现场检测的优点，具有极大的应用价值和应用前景。但是，常见的黄曲霉毒素BI免疫层析检测试纸条仅有一条检测线，只能对样品中的黄曲霉毒素BI进行定性检测，且灵敏度较低。所以研究建立针对黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析快速检测试纸条，从而实现对样品中的黄曲霉毒素BI高、中、低三个浓度含量的半定量检测，对监控食品和农产品中的黄曲霉毒素BI具有重要的意义和很高的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条。本专利技术提供了杂交瘤细胞株AFB3G1，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCN0.C201015。其具有序列表中SEQ ID N0.1所示的单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID N0.2所示的单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC N0.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。该单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素BI，对黄曲霉毒素BI 的 50%抑制浓度 IC50 为 0.086ng/mL。本专利技术提供的杂交瘤细胞株AFB3G1是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为:将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素BI完全抗原AFBl-BSA免疫4_6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素BI完全抗原AFBl-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，采用ELISA方法分两步筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素BI而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素BI作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株AFB3G1。本专利技术提供的单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株AFB3G1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后即得。按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作步骤为:用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4°C，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30 35 μ L，室温混合30 60min，4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.lmol/L和PH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，4°C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的单克隆抗体，将抗体置_20°C冰箱中备用； 所述的醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.14ImL醋酸，纯水定容至IOOmL ； 所述的0.01mol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至IOOmL ； 所述的0.lmol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到IOOmL所得。半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条(见图1和图2)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线1、检测线II和检测线III，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线1、检测线II和检测线III分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA);所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体，所述的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC N0.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体。按上述方案，所述的吸水垫长16-18mm，宽2_4mm ;检测垫长25_30mm，宽2_4mm ;金标垫长6_9本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞株AFB3G1，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC?NO.C201015。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株AFB3G1，其特征在于:它保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC N0.C201015。2.单克隆抗体，其特征在于:它由保藏编号为CCTCCN0.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生。3.半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于:它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线1、检测线II和检测线III，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线1、检测线II和检测线III分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体，所述的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体为由权利要求I所述的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体。4.根据权利要求3所述的半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于:所述的吸水垫长16-18mm，宽2_4mm ;检测垫长25_30mm，宽2_4mm ;金标垫长6-9mm,宽2_4mm ;样品垫长12_18mm,宽2_4mm,相邻各垫的交叠长度为l_3mm。5.根据权利要求3或4所述的半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于:所述检测垫上检测线1、检测线II和检测线III距硝酸纤维素膜上沿的距离分别为11 17mm、13 19mm、15 21mm,且每相邻两条检测线的间距最小为2mm ;所述质控线与检测线I的距离为5 11mm。6.根据权利要求3或4所述的半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于:所述检测垫上每厘米检测线1、检测线II和检测线III上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)的包被量分别为120 600ng，40 200ng和20 IOOng ;每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200 500ng。7.根据权利要求3或4所述的半定量化检测黄曲霉毒素BI的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于:所述金标 垫中所用的纳米金的粒径为15 20nm ;所述金标垫上每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素BI单克隆抗体的用量为60 216ng。8.半定量化检测黄曲霉毒素BI的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:它包括以下步骤: (1)吸水垫的制备 将吸水纸剪裁即得吸水垫； (2)检测垫的制备 检测线的包被: 将市售黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)配制成0.1 0.5mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿11 17mm、13 19mm、15 21mm的位置,用点喷方式将其依次横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线1、检测线II和检测线III，且每条检测线之间的间距至少为2mm，每厘米检测线1、检测线II和检测线III所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)的包被量分别为120 600ng，40 200ng和20 lOOng，再于37 40°C条件下干燥8 20分钟； 质控线的包被: 将兔抗鼠多克隆抗体配制成0.4 0.6mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上检测线I的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，张兆威，张奇，丁小霞，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：