【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及杂交瘤细胞株vand8及其产生的抗香兰素单克隆抗体和应用，属于免疫化学领域。
技术介绍
1、香兰素作为香精是常见的食品添加剂。虽然其没有毒性，但过量食用也可伤害人体健康，据欧盟专家委员会2000年02月24日报道，人体大量摄入香兰素等食品添加剂可导致头疼、恶心、呕吐、呼吸困难甚至构成肝、肾损伤。粮食及农业组织(fao)和世界卫生组织(who)联合专家委员会限制的香兰素每日最大摄入量为10mg/kg，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(gb2760-2014)同样规定了香兰素在食品中的使用限量[2]。在中国巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳、稀奶油中不得添加食品用香精、香料，0至6个月婴儿配方食品中不得添加任何食用香料，较大婴儿和幼儿配方食品中香兰素的最大使用量为5mg/100ml，婴幼儿谷类辅助食品中香兰素的最大使用量为7mg/100g。因此需要对食品中香兰素的使用进行严格监管，而乳制品、烘焙食品、饮料和食用油是需要进行香兰素含量检测的重点。
2、现有文献报道食品中香兰素的检测方法有高效液相色谱法、高效液相-串联质谱法、气相色谱法、紫外分光光度法等。这些方法灵敏度高，检测结果准确，但所需的仪器设备昂贵，样品前处理过程繁琐。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测。相对而言，免疫分析技术成本低，可用于快速检测。但要研究建立针对香兰素的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得高质量的抗香兰素的抗体。
技术
1、本专利技术所要解决的问题是针对现有技术的不足而提供杂交瘤细胞株vand8及其产生的抗香兰素单克隆抗体和应用。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了杂交瘤细胞株vand8，该细胞株已于2023年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno.c 2023186，分类命名为小鼠杂交瘤细胞vand8，hybridoma cell line vand8。
4、本专利技术第二方面提供了抗香兰素单克隆抗体，其重链可变区具有序列表中seq idno:3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中seq id no:4所示的氨基酸序列。其由保藏编号为cctcc no.c2023186的杂交瘤细胞株vand8分泌产生。该抗香兰素单克隆抗体可以识别香兰素，对香兰素的50％抑制浓度ic50为22.1μg/ml，与香兰素结构类似物交叉反应率低甚至无交叉反应，与乙基香兰素交叉反应率为21.65％，与甲基香兰素的交叉反应率小于1％。
5、本专利技术提供的杂交瘤细胞株vand8是采用两步筛选法获得的。具体步骤为：使用van完全抗原对balb/c小鼠进行4-5次免疫，最后一次加强免疫用2倍于前一次免疫剂量的van-bsa免疫3天后进行细胞融合。采用elisa方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接elisa法筛选出仅能抗香兰素而不抗载体蛋白bsa的阳性克隆；第二步采用间接竞争elisa法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用香兰素作为竞争原，选择吸光值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株vand8。
6、上述van完全抗原的具体制备步骤为：
7、称取香兰素胺盐酸盐在三乙胺的催化下与顺丁烯二酸酐室温反应得到半抗原：(2z)-4-[(4-羟基-3甲氧基)苄氨基]-4-羰基-2-烯酸((2z)-4-[(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-4-oxobut-2-enoic acid)，分子式为c12h13no5，相对分子质量为251.2；活泼酯法合成香兰素完全抗原van-bsa：将上述半抗原与nh2oh进行肟化反应，然后在二环己基碳二亚胺(dcc)作用下，与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)避光反应，取上清活泼酯液与bsa偶联，获得完全抗原van-bsa。
8、
9、本专利技术进一步提供了抗香兰素单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株vand8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的balb/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗香兰素单克隆抗体。
10、本专利技术的有益效果在于：
11、(1)本专利技术提供的杂交瘤细胞株vand8可以用于制备高效价抗香兰素单克隆抗体，抗香兰素小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(elisa)法测得的效价可达3.2×105。为今后开发操作简便、适用范围广、灵敏度高的香兰素免疫学检测技术提供了核心原料。
12、(2)本专利技术提供的抗香兰素单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对香兰素的50％抑制浓度ic50为22.1μg/ml，与香兰素结构类似物交叉反应率低甚至无交叉反应，与乙基香兰素交叉反应率为21.65％，与甲基香兰素的交叉反应率小于1％。
13、(3)本专利技术提供的抗香兰素单克隆抗体可应用于测定香兰素含量。
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1.杂交瘤细胞株VAND8，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2023186。
2.抗香兰素单克隆抗体，其特征在于：重链可变区具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗香兰素单克隆抗体在香兰素测定中的应用。
4.根据权利要求2所述的抗香兰素单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的杂交瘤细胞株VAND8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗香兰素单克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株vand8，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.c2023186。
2.抗香兰素单克隆抗体，其特征在于：重链可变区具有如seq id no:3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有如seq id no:4所示的氨基酸序列。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：王督，李培武，黄雅涓，张奇，张文，唐晓倩，马飞，姜俊，白艺珍，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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