【技术实现步骤摘要】
本公开涉及用于生产重组腺相关病毒载体的方法及用于生产重组腺相关病毒载体的包装/生产细胞。具体地，本公开涉及通过在重组腺相关病毒载体的生产方法中以及在重组腺相关病毒载体的包装/生产细胞的构建中使用特定的基因序列作为辅助基因从而提高重组腺相关病毒载体的产率。
技术介绍
1、腺相关病毒(aav)属于细小病毒科(parvoviridae)依赖性细小病毒属(dependoparvovirus)，其需要在辅助病毒(如腺病毒)存在下才能完成病毒复制。aav是一种小的非包膜病毒，其基因组由单链dna组成，长度约为4.7kb，包含rep和cap两个基因表达框，rep基因编码病毒复制所需蛋白，cap基因编码衣壳蛋白。在rep和cap基因表达框两侧的是反向末端重复序列(itr)，其是病毒dna复制的起始信号。不同衣壳蛋白决定了aav的血清型，如aav2、aav5、aav8、aav9等。
2、可以通过基因工程方法将aav基因组中的rep和cap基因表达框替换为外源目的核酸片段来产生含有外源目的基因的重组腺相关病毒(raav)载体。raav因其能有效地将基因传递到目标细胞并且具有低毒性和低免疫原性的特性，而被广泛应用于基因疗法中。
3、由于aav具有复制缺陷，因此在raav的生产过程中，需要存在能够提供必要的辅助因子以帮助raav复制的辅助病毒(helper virus)(例如，腺病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒)，或者在不使用辅助病毒的情况下，需要向用于raav生产的宿主细胞提供来源于其他病毒的用于促进aav复制和组装的辅助基因(he
4、l4基因是腺病毒基因组的一部分，属于晚期转录单元，主要编码构成病毒衣壳的蛋白质或参与衣壳组装的蛋白质。l4基因长度约为3.7kbp。在ad5基因组中的占比大约为10％。l4基因编码了4种重要的蛋白质：l4-100k、l4-33k、l4-22k和pviii。l4-33k蛋白在病毒生命周期中从早期到晚期基因表达的转换中起作用，其是一种剪接因子，影响病毒rna转录本的处理，使病毒能够产生组装新病毒颗粒所需的蛋白质(wu k等,the adenovirus l4-33k protein regulates both late gene expression patterns and viral dnapackaging.j virol.2013；87(12):6739-6747)。在ad5的l4区域中，l4-22k编码区与l4-33k编码区重叠。l4-22k蛋白与l4-33k蛋白一样，也参与病毒基因表达的调控，通过影响病毒rna转录本的剪接，参与病毒生命周期从早期到晚期的转换(wu k等,同上)。
5、raav基因治疗产品的快速增加催生了对大规模生产能力的巨大需求。然而，现有的产业生产能力仍然不足以满足未来商业化和广泛患者使用的需求。目前的无病毒辅助生产系统，即使在优化的细胞培养条件下，也只能以较低滴度生产raav载体。因此目前亟需一种提高raav载体产量的方法。
技术实现思路
1、本专利技术人首次发现将腺病毒基因组中的特定基因加入到raav生产系统中作为辅助基因能够显著提高raav载体的产量，从而有望解决raav载体在商业化生产中面临的产量瓶颈问题。
2、在一个方面，本公开提供一种生产raav载体的方法，所述方法中不使用腺病毒作为辅助病毒，并且所述方法包括使用编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列和/或编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸序列作为用于raav载体生产的辅助基因序列。所述腺病毒l4-22k蛋白可以是来源于腺病毒科的野生型l4-22k蛋白，也可以是与来源于腺病毒科的野生型l4-22k蛋白的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性并且能够产生同样或类似的提高raav载体产量的效果的变体。所述腺病毒l4-33k蛋白可以是来源于腺病毒科的野生型l4-33k蛋白，也可以是与来源于腺病毒科的野生型l4-33k蛋白的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性并且能够产生同样或类似的提高raav载体产量的效果的变体。在一个实例中，所述腺病毒是人腺病毒。在一个实例中，所述腺病毒是腺病毒ad5。
3、在一个实例中，在使用编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列和编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸序列两者的情况下，所述编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列和所述编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸序列形成一条核酸序列。在一个实例中，在使用编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列和编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸序列两者的情况下，所述编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列与所述编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸序列重叠。
4、在一个实施方案中，所述生产raav载体的方法还包括使用多种额外的辅助基因序列。
5、在一个实施方案中，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于腺病毒、单纯疱疹病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、人疱疹病毒、博卡病毒或人乳头瘤病毒的一种或多种核酸序列。
6、在一个实施方案中，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于腺病毒e1a、e1b、e2a、e4或va rna基因的核酸序列或其组合。在一个实施方案中，额外的辅助基因序列可以是来源于腺病毒e1a基因的核酸序列，来源于腺病毒e1b基因的核酸序列，来源于腺病毒e2a基因的核酸序列，来源于腺病毒e4基因的核酸序列，或来源于腺病毒va rna基因的核酸序列，或者是这些核酸序列的组合。在一个实施方案中，来源于腺病毒e4基因的核酸序列可以是来源于腺病毒e4orf1、e4orf2、e4orf3、e4orf3/4、e4orf4、e4orf6或e4orf6/7基因的核酸序列，或者是这些核酸序列的组合。
7、在一个实施方案中，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于单纯疱疹病毒(hsv)ul5、ul8、ul12、ul29、ul30、ul42、ul52、icp0、icp4、icp22、icp34.5或us11基因的核酸序列或其组合。在一个实例中，所述单纯疱疹病毒是单纯疱疹病毒1型(hsv-1)。
8、在一个实施方案中，所述来源于丙型肝炎病毒(hcv)的核酸序列可以是来源于丙型肝炎病毒ns5a基因的核酸序列。
9、在一个实施方案中，所述来源于流感病毒的核酸序列可以是来源于流感病毒ns1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产重组腺相关病毒载体的方法，其特征在于，在所述方法中不使用腺病毒作为辅助病毒，并且所述方法包括使用编码腺病毒L4-22K蛋白的核酸序列和/或编码腺病毒L4-33K蛋白的核酸序列作为用于重组腺相关病毒载体生产的辅助基因序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用多种额外的辅助基因序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于腺病毒、单纯疱疹病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、人疱疹病毒、博卡病毒或人乳头瘤病毒的一种或多种核酸序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于腺病毒E1A、E1B、E2A、E4或VA RNA基因的核酸序列或其组合。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于单纯疱疹病毒UL5、UL8、UL12、UL29、UL30、UL42、UL52、ICP0、ICP4、ICP22、ICP34.5或US11基因的核酸序列或其组合。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，并且可以选自HEK293细胞、A549细胞、Hela细胞、HepG2细胞、BHK细胞、COS细胞、Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、CAP细胞，及其衍生细胞。
8.一种重组腺相关病毒载体包装/生产细胞，其用于在不使用腺病毒作为辅助病毒的情况下生产重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述包装/生产细胞包含腺病毒L4-22K蛋白或其编码核酸和/或腺病毒L4-33K蛋白或其编码核酸。
9.根据权利要求8所述的包装/生产细胞，其特征在于，所述包装/生产细胞还包含来源于腺病毒E1A、E1B、E2A、E4或VA RNA基因的核酸序列或其组合。
10.根据权利要求8所述的包装/生产细胞，其特征在于，所述包装/生产细胞还包含来源于单纯疱疹病毒UL5、UL8、UL12、UL29、UL30、UL42、UL52、ICP0、ICP4、ICP22、ICP34.5或US11基因的核酸序列或其组合。
11.腺病毒L4-22K蛋白或其编码核酸和/或腺病毒L4-33K蛋白或其编码核酸用于在不使用腺病毒作为辅助病毒的情况下生产重组腺相关病毒载体的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种生产重组腺相关病毒载体的方法，其特征在于，在所述方法中不使用腺病毒作为辅助病毒，并且所述方法包括使用编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列和/或编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸序列作为用于重组腺相关病毒载体生产的辅助基因序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用多种额外的辅助基因序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于腺病毒、单纯疱疹病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、人疱疹病毒、博卡病毒或人乳头瘤病毒的一种或多种核酸序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于腺病毒e1a、e1b、e2a、e4或va rna基因的核酸序列或其组合。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种额外的辅助基因序列包括来源于单纯疱疹病毒ul5、ul8、ul12、ul29、ul30、ul42、ul52、icp0、icp4、icp22、icp34.5或us11基因的核酸序列或其组合。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述编码腺病毒l4-22k蛋白的核酸序列和/或编码腺病毒l4-33k蛋白的核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛博夫，杨炜钐，杨银辉，陈莉，马墨，
申请(专利权)人：深圳市深研生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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