一种重组核糖-5-磷酸异构酶及其应用制造技术

一种重组核糖-5-磷酸异构酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术构建了重组表达载体pET22-tlRpib，获得了基因工程菌株BL21（DE3）/pET22-tlRpib。发酵获得了重组Thermotogalettingae核糖-5-磷酸异构酶，用ni2+亲和柱进行分离纯化得到了纯度95%以上的重组酶tl-Rpib。该重组酶催化D-阿洛酮糖与D-阿洛糖之间的酮醛异构化反应生产D-阿洛糖，反应达到平衡以后转化率可达31%。该酶具有良好的耐热性，不需要金属离子参与催化反应，产物分离纯化难度小，在较宽的pH(6-9)范围内能保持80%以上的最大酶活,可以应用于稀有糖D-阿洛糖的大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种 菌来源的核糖_5_磷酸异构酶基因(EC5. 3. I. 6,ribose- 5- phosphate isomerase, RPI)在大肠杆菌BL21 (DE3)中的可溶性表达,以及表达产物重组酶的分离纯化和在稀有糖D-阿洛糖(D-allose)的生产中的应用，属于生物工程

技术介绍
D-阿洛糖，是D-葡萄糖的C-3位置上的差向异构体、D-阿洛酮糖的醛糖异构体。D-阿洛糖这种无毒、无卡路里、具广泛生理功能的稀有糖正成为近年来的功能性稀有糖的研究热点。D-阿洛糖的生理功能包括抑制氧化原因导致的癌症发生，并且能够抑制不同来源的癌细胞系；可以作为抗氧化剂抑制活性氧自由基造成的氧化伤害；可以抑制高钠诱 导型高血压血压的升高；可以作为抗炎剂保护局部缺血伤害、细胞冷冻的保护剂；还具有 免疫抑制作用，可用于外科手术和器官移植的保护。化学法生产D-阿洛糖需要复杂的纯化步骤，有副产物生成较多，产量较低及底物不可重复利用等缺点。D-阿洛糖的生物转化可由D-果糖经两步酶反应催化生物合成。首先由D-塔格糖-3-差相异构酶催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。生成的稀有糖D-阿洛酮糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于Thermotoga？lettingae的重组核糖？5？磷酸异构酶tl？Rpib，其基因核苷酸序列为？SEQ？ID？NO:1。

【技术特征摘要】
1.ー种来源于Thermotoga Iettingae的重组核糖_5_磷酸异构酶tl-Rpib,其基因核苷酸序列为SEQ ID NO: I。2.根据权利要求I所述的重组核糖-5-磷酸异构酶，其氨基酸序列为SEQID N0:2。3.权利要求I所述的重组核糖-5-磷酸异构酶的表达、分离、纯化方法，其特征在于人工合成基因SEQ ID N0:1，两端设计Nde I和Xho I限制性内切酶识别序列，酶切处理后连接到载体pET-22b (+)上获得pET22- tlRpib重组质粒，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选到阳性克隆获得基因工程菌株BL21 (DE3) /pET22-tlRpib ;步骤为 Cl)重组表达载体pET22-tlRpib的构建 合成带Ndel/Xhol酶切位点的Thermotoga Iettingae的核糖_5_磷酸异构酶基因SEQID NO: I 连接入 pET-22b (+)得到 pET22_ tlRpib 质粒； (2)基因工程菌株BL21(DE3)/ pET22_ tlRpib的获得: .100 μ L BL21感受态细胞悬液中加入2 μ L pET22_tlRpib质粒，轻轻混匀； 冰浴静置30min，均匀涂布含100yg/mL氨苄青霉素的LB平板，37°C倒置培养12_15h得到阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21(DE3) / pET22- tlRpib ； (3)重组tl-Rpib酶的获得 用兼性厌氧的大肠杆菌基因工程菌表达厌氧的Thermotoga Iettingae菌的核糖-5-磷酸异构酶基因Rpib，种子在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鮮的含氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养至OD6tltl为O. 8-2时，加入O. I- 5. OmM的异丙基-β- D-硫代半乳糖苷IPTG，温度20-40°C诱导表达数小时获得重组酶的大量...

【专利技术属性】
技术研发人员：江波，沐万孟，冯再平，张涛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：