矿化口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种矿化口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。本发明专利技术利用口蹄疫VLPs大肠杆菌表达组装技术平台，通过基因工程手段，将三种能有效富集钙离子的矿化肽分别插入到口蹄疫病毒结构蛋白VP1的loop环中，结果表明，嵌合矿化肽的VP1与口蹄疫病毒的结构蛋白VP0以及VP3在大肠杆菌中能够成功表达并组装成完整的VLPs，且对组装效率并未造成影响，后用矿化剂成功实现了对病毒样颗粒的矿化，同时提高了口蹄疫病毒VLPs的组装效果。本发明专利技术的提出推动了蛋白类疫苗由冷链疫苗向常温疫苗转化的步伐，为常温疫苗的应用提供了新的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
矿化口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法，特别涉及一种矿化口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法，还涉及该矿化口蹄疫病毒样颗粒在防治口蹄疫疾病中的用途，本专利技术属于兽用药物研究

技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是偶蹄动物的一种烈性传染病，给世界各国带来严重的经济损失。2001年UK爆发FMD，共屠杀了600万头动物，直接经济损失超过8亿英镑，故各国增强了疫苗需要和活畜免疫的政策。欧美等发达国家现已达到无口蹄疫状态，但在亚洲、非洲等发展中国家口蹄疫仍有大面积的流行，疫苗免疫是这些国家控制口蹄疫的主要措施。目前所用的FMD疫苗是在大型生物反应罐中生产的灭活苗，其有以下缺点：(1)建立和运行成本高；(2)全球生产能力较差；(3)受周围环境影响，疫苗稳定性较差，储存和运输成本高，需要冷链；(4)难以区分感染动物和免疫动物；(5)生产中使用活毒，有散毒的风险。因此,迫切需要研发更理想的疫苗。病毒样颗粒(Viruslikeparticles,VLPs)是一种结构、性质与活病毒粒子相似但不含病毒基因的空衣壳，许多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种矿化口蹄疫病毒样颗粒，其表面覆盖有磷酸钙外壳，其特征在于所述的矿化口蹄疫病毒样颗粒是由口蹄疫病毒样颗粒经矿化处理后得到，所述的口蹄疫病毒样颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、嵌合矿化肽的结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，其中编码嵌合矿化肽的结构蛋白VP1的基因序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示，编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQ ID NO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种矿化口蹄疫病毒样颗粒，其表面覆盖有磷酸钙外壳，其特征在于所述的矿化口蹄疫病毒样颗粒是由口蹄疫病毒样颗粒经矿化处理后得到，所述的口蹄疫病毒样颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、嵌合矿化肽的结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，其中编码嵌合矿化肽的结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8或SEQIDNO.9所示，编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示。2.如权利要求1所述的矿化口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于嵌合矿化肽的结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.9所示。3.如权利要求1所述的矿化口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于所述的矿化处理是指将得到的口蹄疫病毒样颗粒加入到pH7.4的包含Na+80～100mM,K+1～10mM,Ca2+1～5mM，Mg2+1～10mM,Cl-100～200mM,HCO3-10～20mM，HPO42-1～10mM,PO43-1～10mM的矿化液I中，室温作用10min；然后向矿化液I中加入等体积pH7.4的包含Na+80～150mM,Mg2+2～20mM,Ca2+1～20mM,Cl-100～200mM,HCO3-100～200mM,HPO42-1～10mM,PO43-1～10mM的矿化液II，4℃作用过夜，以16000rpm离心10min，即得表面覆盖有磷酸钙外壳的矿化口蹄疫病毒样颗粒。4.一种构建权利要求1所述的矿化口蹄疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建含有编码口蹄疫病毒结构蛋白VP0、嵌合矿化肽的结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3基因的重组质粒，其中编码嵌合矿化肽的结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8或SEQIDNO.9所示，编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示；(2)口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、嵌合矿化肽的结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3的表达和纯化；(3)口蹄疫病毒样颗粒的组装；(4)口蹄疫病毒样颗粒的矿化。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)重组质粒pSMK/VP0-VP1以及pSMA/VP3的构建1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体pSMA；2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建根据已公布的GenBank登陆号为JN998085的O型口蹄疫病毒的序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0，VP3和VP1；以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA3’VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG3’VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，杜平，滕志东，唐睿康，赵瑞波，茹嘉喜，魏衍全，张韵，郜原，马军武，刘湘涛，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，浙江大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62