修饰后诺如病毒VP1蛋白和包含修饰后诺如病毒VP1蛋白的VLP制造技术

提供编码修饰后诺如病毒VP1蛋白的核酸，以及包括修饰后诺如病毒VP1蛋白中的一个或多个蛋白的VLP。还描述由植物、植物的部分或植物细胞产生修饰后诺如病毒VP1蛋白和诺如病毒VLP的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰后诺如病毒VP1蛋白和包含修饰后诺如病毒VP1蛋白的VLP
本专利技术涉及修饰后诺如病毒(norovirus)VP1蛋白、包含修饰后诺如病毒VP1蛋白的VLP以及其产生方法。
技术介绍
由诺如病毒感染造成的全球疾病负担较重，估计与全世界所有腹泻病例的20％相关并且每年死亡人数超过20万人。诺如病毒是北美洲食源性疾病爆发的主要原因，也是老年人当中大部分医院获得性爆发的病原体。诺如病毒株还被认为是全球小儿胃肠道疾病的主要原因。诺如病毒包括杯状病毒科(Caliciviridae)的多个属之一。人类诺如病毒基因组是编码三个开放阅读框(ORF)并由VPg蛋白在其5’端封端的单链正义RNA分子。ORF1编码六种非结构性病毒蛋白，包含VPg、RNA依赖性RNA聚合酶和病毒蛋白酶。ORF2编码主要结构性衣壳蛋白(VP1)。ORF3编码次要衣壳蛋白(VP2)。VP1包括2个结构域：壳体(S)结构域和突起(P)结构域(protrudingdomain)。例如GI.1毒株的S结构域包括前225个N端氨基酸并且含有衣壳组装以及病毒二十面体的形成所需的结构要素。P结构域包括VP1蛋白的剩余部分且进一步包括P1亚结构域和P2亚结构域。P2亚结构域被称为高变结构域并且被认为在受体结合和免疫反应性方面起到重要作用。VP1蛋白通过P结构域介导的蛋白质相互作用形成二聚体。二聚化增加病毒粒子衣壳的稳定性并且使得形成由S结构域形成的诺如病毒颗粒的碱基核心延伸的突起。在表达时，诺如病毒VP1蛋白可自动组装以形成2个病毒粒子结构：180-mer衣壳结构，具有T＝3二十面体对称，直径为38-40nm；以及60-mer衣壳结构，具有T＝1二十面体对称，直径为23nm。次要结构蛋白VP2具有大约21kDa至24kDa的分子量(MW)。研究表明VP2是高度碱性的并且位于衣壳内部。VP2的功能尚未充分了解，但普遍认为其通过防止病毒粒子分解和降解而在衣壳稳定性方面发挥重要作用(ertolotti-CiarletA.、CrawfordS.E.、HutsonA.M.、EstesM.K.2003，病毒学杂志(J.Virol.)77：11603-11615)。VP2还可能在RNA基因组封装期间起到作用。VP2次要结构蛋白在病毒粒子中的量相对较低，其中1.5至8个拷贝并入成熟病毒粒子。Bertolotti-Ciarlet等人(2003)报告，在昆虫和哺乳动物细胞中，由VP1/VP2构成的VLP比仅含有VP1的VLP更耐蛋白酶裂解，且VP2的顺式表达使得VP1蛋白产量增加。另外，ORF2基因下游的3’UTR的存在增加NVORF2mRNA的稳定状态水平。当表达驻留在同一构建体上且在一个启动子的调控下的ORF2+ORF3+3’UTR时，观察到VP1表达的最大增加。VP2的反式表达并未引起VP1表达的任何增加，从而指示ORF2-ORF2-3’UTR的亚基因组组织为VP1产量的观察到的增加所需。诺如病毒是根据其VP1氨基酸序列的系统发育聚类进行分类的。目前为止，已分类出七个基因群(GI至GVII)，其中已知仅GI、GII和GIV会感染人类。在目前与人类感染相关的32个特定基因型中，GII.4诺如病毒为大部分近期诺如病毒爆发的原因。GII.4的新毒株每两至三年出现一次，通过由表位中的突变驱动的过程进化，所述表位决定VP1的高变P2结构域的区。这个过程允许诺如病毒逃避先前暴露于较早毒株所获得的体液免疫应答。在面临使诺如病毒株迅速进化和遗传多样化的困难的同时，其它挑战使得有效诺如病毒疫苗的开发情况恶化。举例来说，直到最近，人类诺如病毒仍不能在细胞培养中生长，且即使现在，仍缺乏用于VLP和减毒活诺如病毒的稳固细胞培养系统。疫苗开发的另一个挑战在于对于诺如病毒感染的免疫是毒株和基因型特异性的，针对其它基因组具有最小交叉免疫。此外，对诺如病毒株的免疫并不是终生的，且估计从任何时候开始持续六个月到九年。已采取各种方法来开发抵抗诺如病毒感染的合适疫苗，所述方法包含在昆虫和植物表达系统中产生重组诺如病毒蛋白。Huo等人(病毒研究(VirusResearch)，2015，204：1-5)证实在昆虫SF9细胞中产生的诺如病毒VP1VLP的M27G突变衣壳蛋白使得产生包括58kDa和55kDa蛋白的38nm和21nmVLP。55kDa蛋白是全长P1衣壳蛋白的降解或裂解的结果，而不是内部起始密码子的转译产物。包括VP1蛋白的26或38个缺失氨基酸残基的N端缺失突变体使得产生21nmVLP。26个氨基酸缺失的突变体产生较低数量的38nmVLP，而38个氨基酸缺失的突变体未形成38nmVLP。US2013/0273105教示包括来源于基因组I(G1)、基因组II(GII)或共有病毒序列的抗原肽、蛋白质或VLP的诺如病毒制剂的产生。诺如病毒抗原可包含表达在VLP中的衣壳蛋白的变异体。US2015/0023995提供一种疫苗制剂，其包括在昆虫Sf9细胞中产生的VLP，所述VLP包括来源于至少两个病毒蛋白序列的复合氨基酸序列。举例来说，描述了包括来自GII.4Minerva2006-a以及GII.4Laurens2006-b和GII.4Houston2002诺如病毒株的VP1序列的复合GII.4VP1VLP。还描述了来源于GII.1、GII.2SnowMountain和GII.3的复合序列，以及来源于NorwalkGI.1、SouthamptonGI.1和ChibaGI.1的GI复合序列。Mason等人(美国科学院院报(ProcNatlAcadSciU.S.A.)，1996，93(11)：5335-40)教示基因工程烟草植物和马铃薯块茎表达来自天然VP1蛋白的GI.1诺如病毒VLP的用途。植物产生的诺如病毒VLP在形态上和物理上都类似于在昆虫细胞中产生的38nmNorwalkVLP。经口施用来自天然衣壳蛋白的经过纯化的烟草产生的NorwalkVLP或表达GI.1衣壳蛋白的马铃薯块茎诱导小鼠和人类的体液免疫应答(Tacket等人，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，2000，182(1)：302-5)。Huang等人(生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)，2009，103(4)：706-14)描述了一种用于在植物中产生GI.1诺如病毒VLP的双生病毒来源DNA复制子载体。在本氏烟(Nicotianabenthamiana)中共同递送大豆矮黄病毒来源载体和Rep/RepA供应载体引起迅速且稳固的蛋白质产生。
技术实现思路
本专利技术涉及修饰后诺如病毒蛋白、包括修饰后诺如病毒蛋白的病毒样颗粒(VLP)和产生诺如病毒蛋白的方法，以及包括修饰后诺如病毒蛋白的病毒样颗粒(VLP)。本专利技术的目的在于产生修饰后诺如病毒蛋白、包括修饰后诺如病毒蛋白的VLP，且在于在植物中产生包括修饰后诺如病毒蛋白的VLP。如本文中所描述，提供了一种重组多核苷酸，其包括编码修饰后诺如病毒VP1蛋白的核苷酸序列，其中所述修饰后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组多核苷酸，包括编码诺如病毒VP1的核苷酸序列，所述诺如病毒VP1包括：/n在选自与诺如病毒VP1基因型GI.1(SEQ ID NO：1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的氨基酸的一位置处的一个或多于一个取代，/n与诺如病毒VP1基因型GI.1(SEQ ID NO：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，/n与诺如病毒VP1基因型GI.1序列比对的被修饰成序列SSTAVATA的氨基酸39至46，或/n其组合，且/n所述核苷酸序列不是源于基因型GI.1诺如病毒VP1。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171130 US 62/593,006;20180731 US 62/712,7441.一种重组多核苷酸，包括编码诺如病毒VP1的核苷酸序列，所述诺如病毒VP1包括：
在选自与诺如病毒VP1基因型GI.1(SEQIDNO：1)的氨基酸43、57、84和94序列比对的氨基酸的一位置处的一个或多于一个取代，
与诺如病毒VP1基因型GI.1(SEQIDNO：1)的氨基酸39至46序列比对的肽片段的缺失，
与诺如病毒VP1基因型GI.1序列比对的被修饰成序列SSTAVATA的氨基酸39至46，或
其组合，且
所述核苷酸序列不是源于基因型GI.1诺如病毒VP1。


2.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述核苷酸序列源于选自由以下组成的组的诺如病毒VP1：GI.3、GI.5、GI.7、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.12和GII.17。


3.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中在与氨基酸43序列比对的所述位置处的所述一个或多余一个取代是取代为缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸。


4.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中在与氨基酸57序列比对的所述位置处的所述一个或多于一个取代是取代为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸。


5.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中在与氨基酸84序列比对的所述位置处的所述一个或多于一个取代是取代为丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸或组氨酸。


6.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中在与氨基酸94序列比对的所述位置处的所述一个或多于一个取代是取代为亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸。


7.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中针对人类密码子使用、增大GC含量或其组合优化所述核苷酸序列的密码子使用。


8.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包括载体。


9.一种诺如病毒VP1蛋白，其由如权利要求1至8中任一项所述的重组多核苷酸所编码。


10.一种病毒样颗粒(VLP)，包括如权利要求9所述的诺如病毒VP1。


11.根据权利要求10所述的VLP，进一步包括诺如病毒VP2蛋白。


12.一种由植物、植物的部分或植物细胞产生诺如病毒VP1蛋白的方法，包括：
引入如权利要求1至8中任一项所述的重组多核苷酸；和
在允许表达所述诺如病毒VP1蛋白的条件下培育所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括收获所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞的步骤。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞浸提、纯化或浸提并纯化所述诺如病毒VP1蛋白的步骤。


15.一种诺如病毒VP1蛋白，其通过如权利要求13或14所述的方法产生。


16.根据权利要求12所述的方法，其中在所述引入步骤中，将编码诺如病毒VP2蛋白的第二多核苷酸引入到所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞中，且在所述培育步骤中，所述条件允许在所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞中共表达并共产生所述诺如病毒VP1蛋白和所述诺如病毒VP2蛋白两者。


17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包括收获所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞的步骤。


18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法进一步包括浸提、纯化或浸提并纯化所述诺如病毒VP1蛋白和诺如病毒VP2蛋白的步骤。


19.一种在植物、植物的部分或植物细胞中产生诺如病毒样颗粒(VLP)的方法，包括：
引入如权利要求1至8中任一项所述的重组多核苷酸；和
在允许表达所述诺如病毒VLP的条件下培育所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞。


20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法进一步包括收获所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞的步骤。


21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞浸提、纯化或浸提并纯化所述诺如病毒VLP的步骤。


22.一种诺如VLP，其通过如权利要求21所述的方法产生。


23.根据权利要求19所述的方法，其中在所述引入步骤中，将编码诺如病毒VP2蛋白的第二多核苷酸引入到所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞中，且在所述培育步骤中，所述条件允许在所述植物、所述植物的部分或所述植物细胞中共表达并共产生所述诺如病毒VP1蛋白和所述诺如病毒VP2蛋白两者。


24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法进一步包括收获所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞的步骤。


25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述植物、所述植物的所述部分或所述植物细胞浸提、纯化或浸提并纯化病毒样颗粒(VLP)的步骤，其中所述VLP包括所述诺如病毒VP1蛋白和所述诺如病毒VP2蛋白。


26.一种病毒样颗粒(VLP)，包括通过如权利要求25所述的方法产生的所述诺如病毒VP1蛋白和所述诺如病毒VP2蛋白。


27.一种产生抗体或抗体片段的方法，包括向受试者或宿主动物施用如权利要求9所述的诺如病毒VP1蛋白，从而产生所述抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：皮尔奥利弗·拉沃伊，马克安德鲁·德奥斯特，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA