在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法。本发明专利技术通过在马铃薯Y病毒cDNA的类原核启动子区插入内含子，用于降低或消除类原核启动子区的启动子活性，经修饰马铃薯Y病毒cDNA编码的氨基酸序列与马铃薯Y病毒编码cDNA的氨基酸序列相同。该方案改善了现有技术中马铃薯Y病毒cDNA对原核细胞的固有毒性，避免马铃薯Y病毒对原核细胞生长产生影响，提高马铃薯Y病毒cDNA的产率，同时不改变马铃薯Y病毒RNA转录物的感染性。

Methods of proliferating functional potato Y virus in prokaryotic cells

【技术实现步骤摘要】
在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法。
技术介绍
马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)是危害最为严重的植物病毒之一，其广泛的分布在世界各地的马铃薯和烟草种植区。PVY侵染马铃薯和烟草后，会引起叶脉坏死、叶面黄化褪绿、块茎环斑坏死等症状，导致马铃薯和烟草种质退化，产量降低，给马铃薯和烟草的生产造成严重损失。PVY是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)代表成员，病毒粒体呈弯曲线状，其基因组由正义单链RNA构成，长约9.7kb，包含一个大的开放阅读框(Openreadingframe,ORF)，两端含有非编码区(Untranslatedregions，UTRs)。在进行翻译时，开放阅读框先编码一个多聚蛋白(Polyprotein)，之后再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白切割加工为P1、HC-Pro、P3等10个成熟蛋白。此外，PVY基因组内还有一个通过+2相位移码翻译产生的蛋白-PIPO，该蛋白与P3蛋白的N’端以P3N-PIPO融合形式存在。最终，PVY基因组通过这两种方式生成11个成熟的多功能蛋白。PVY分离物具有显著的株系多样性，其株系类型包括非重组株系，如PVYN、PVYO、PVYC、PVYE等和重组株系，如PVYN:O、PVYNW、PVYN-Wi、PVYNTN-NW等。其中PVYNTN-NW株系会造成马铃薯块茎环斑坏死症状和烟草叶片皱缩坏死症状，严重影响马铃薯和烟草的产量与品质。植物病毒侵染性克隆是病毒致病机制和病毒与植物互作等研究的重要技术手段。目前已成功构建的马铃薯Y病毒属病毒侵染性克隆有二十余种，如大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)、马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)、芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)等。然而该属仍有很多病毒无法顺利构建侵染性克隆。除此之外，传统构建侵染性克隆的方法中涉及到多个亚克隆和酶切酶连步骤，这些步骤会增加病毒序列突变的潜在可能性以及引入非病毒核苷酸，从而影响病毒的侵染、转录等生物学特性。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种经修饰马铃薯Y病毒cDNA。本专利技术的第二目的在于提供经修饰马铃薯Y病毒cDNA的互补核苷酸序列。本专利技术的第三目的在于提供经修饰马铃薯Y病毒cDNA的RNA转录物。本专利技术的第四目的在于提供一种载体或原核细胞。本专利技术的第五目的在于提供一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种经修饰马铃薯Y病毒cDNA，在马铃薯Y病毒cDNA内一或多个类原核启动子区中含有一或多个内含子；该内含子用于降低或消除类原核启动子区的启动子活性，所述经修饰马铃薯Y病毒cDNA编码的氨基酸序列与马铃薯Y病毒编码cDNA的氨基酸序列相同。进一步地，所述马铃薯Y病毒为PVYNTN-NW株系，优选为JL-W1；优选地，所述类原核启动子区的序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，内含子为马铃薯内含子，优选为序列如SEQIDNO.2的内含子。进一步地，内含子插入位点的两端的任意端均至少有一个碱基与内含子在马铃薯基因组的位点相同；优选地，含有内含子的类原核启动子区序列如SEQIDNO.3所示。上述经修饰马铃薯Y病毒cDNA的互补核苷酸序列。上述经修饰马铃薯Y病毒cDNA的RNA转录物。一种载体，含有上述经修饰马铃薯Y病毒cDNA或互补核苷酸序列。一种原核细胞，含有上述载体；优选地，原核细胞包括大肠杆菌。一种在原核细胞中增殖功能性马铃薯Y病毒的方法，将上述经修饰马铃薯Y病毒cDNA引入原核细胞，通过在原核细胞内复制经修饰马铃薯Y病毒cDNA来增殖功能性马铃薯Y病毒。进一步地，所述原核细胞包括大肠杆菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过在马铃薯Y病毒cDNA的类原核启动子区插入内含子，可以降低或消除类原核启动子区的启动子活性，同时，与马铃薯Y病毒编码cDNA的氨基酸序列相比，经修饰马铃薯Y病毒cDNA编码的氨基酸序列并未改变。该方案改善了现有技术中马铃薯Y病毒cDNA对原核细胞的固有毒性，避免马铃薯Y病毒对原核细胞生长产生影响，提高马铃薯Y病毒cDNA的产率，同时不改变马铃薯Y病毒RNA转录物的感染性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1中JL-W1类原核启动子分析图；图2为本专利技术实施例2中重组质粒p35S-PVY-InA、p35S-PVY的结构图；图3A为本专利技术实施例2中重组质粒p35S-PVY-InA转化培养后菌落生长；图3B为本专利技术实施例2中重组质粒p35S-PVY转化培养后菌落生长；图4为本专利技术实施例3中提质粒电泳验证结果，其中，M：DNA分子标准；1-12：质粒Z1-12；图5为本专利技术实施例3中BamHI、PstI单酶切电泳检测结果，其中，M：DNA分子标准；1-12：质粒Z1-12BamHI单酶切；13-24：质粒Z1-12PstI单酶切；图6为本专利技术实施例4中植物生长情况，其中，A：健康植株(阴性对照)；B：基因枪接种植株(接种质粒p35S-PVY-InA)；C：摩擦接种植株(B植株叶片研磨液)；D：摩擦接种(大田感染PVYNTN-NW植株叶片研磨液，阳性对照)；图7为本专利技术实施例5中RT-PCR检测结果，其中，M：DNA分子标准；1：阴性对照；2：基因枪接种植株；3：摩擦接种植株；4：阳性对照；5：以p35S-PVY-InA重组质粒为模板扩增片段；图8为本专利技术实施例5中ELISA检测结果；图9为本专利技术实施例5中Westren-blot检测结果，其中，M：蛋白分子标准；1：阴性对照；2：基因枪接种；3：摩擦接种；4：阳性对照。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。一种经修饰马铃薯Y病毒cDNA，在马铃薯Y病毒cDNA内一或多个类原核启动子区中含有一或多个内含子；该内含子降低或消除了类原核启动子区的启动子活性，经修饰马本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经修饰马铃薯Y病毒cDNA，其特征在于，在马铃薯Y病毒cDNA内一或多个类原核启动子区中含有一或多个内含子；/n该内含子用于降低或消除类原核启动子区的启动子活性，所述经修饰马铃薯Y病毒cDNA编码的氨基酸序列与马铃薯Y病毒编码cDNA的氨基酸序列相同。/n

【技术特征摘要】
1.一种经修饰马铃薯Y病毒cDNA，其特征在于，在马铃薯Y病毒cDNA内一或多个类原核启动子区中含有一或多个内含子；
该内含子用于降低或消除类原核启动子区的启动子活性，所述经修饰马铃薯Y病毒cDNA编码的氨基酸序列与马铃薯Y病毒编码cDNA的氨基酸序列相同。


2.根据权利要求1所述的经修饰马铃薯Y病毒cDNA，其特征在于，所述马铃薯Y病毒为PVYNTN-NW株系，优选为JL-W1；
优选地，所述类原核启动子区的序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的经修饰马铃薯Y病毒cDNA，其特征在于，内含子为马铃薯内含子，优选为序列如SEQIDNO.2的内含子。


4.根据权利要求1-3任一项所述的经修饰马铃薯Y病毒cDNA，其特征在于，内含子插入位点的两端的任意端均至少有一个碱基与内含子在马铃薯基因组的位点相同；
优...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永志，苏颖，李小宇，张春雨，马俊丰，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22