一种IAPV感染性克隆的构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种IAPV感染性克隆的构建方法和应用。一种IAPV感染性克隆，其制备步骤是：(1)IAPV病毒BJ2株基因序列的分段合成；(2)IAPV病毒感染性克隆的组装与构建。本发明专利技术通过荧光定量试验、免疫印迹试验、毒理实验，药物抑制，活体蜜蜂喂毒等实验证明：本发明专利技术所构建的IAPV病毒感染性克隆可以拯救出具有与IAPV野生型病毒感染蜜蜂相同症状的病毒，并且在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选等方面具有广泛的应用价值。

Construction and application of an infectious clone of IAPV

【技术实现步骤摘要】
一种IAPV感染性克隆的构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种IAPV感染性克隆，还涉及一种IAPV感染性克隆的制备方法，以及该克隆拯救出的报告病毒在抗病毒药物筛选中的应用。
技术介绍
蜜蜂以色列急性麻痹病毒(IAPV)于2007年才在以色列被分离鉴定。该病毒可感染各个发育时期的蜜蜂个体(卵、幼虫、蛹、成蜂)和蜂群各级型蜜蜂(工蜂、雄蜂和蜂王)。自在以色列发现此病毒后，在世界各地均发现广泛存在，近年来发现也流行于亚洲地区，尤其是我国蜂群冬季流行较为普遍，已成为危害我国冬季蜂群损失最为严重的病害之一，甚至有的地区其蜂群感染率高达96％。其典型发病症状为:患病蜜蜂体色变暗，绒毛脱落，伴随翅震颤，逐渐麻痹抽搐死亡。病症与ABPV相似，并且其生物学和系统发育学特性都与ABPV和KBV非常接近，同时与ABPV和KBV核酸序列还有65％和75％的同源性。目前为止，实际生产中主要采用蜂群健康管理及其它化学试剂疗法预防IAPV，尚无特效抗IAPV感染的有效药物。为了减少该病毒的感染与发生，药物研发及昆虫病毒学家开展了深入的研究，包括病毒复制机制和致病机理等，以期为研制针对以色列急性麻痹病毒的药物，研发新型抗病毒生物制剂提供理论依据。IAPV病毒属于双顺反子病毒属，双顺反子病毒属病毒基因组为一条正义单链RNA，可以直接作为模板(mRNA)进行病毒蛋白的翻译。典型的双顺反子RNA病毒基因组具有2个不重叠的开放阅读框(openreadingframes，缩写为ORFs)，且在基因组两侧各有一个UTRs。基因组5′端有一个小基因连接蛋白(genome-linkedvirusprotein，缩写为VPg)，3′端连接一个PolyA尾，二者具有维持基因组稳定和防护RNA分子降解的功能。2个ORFs之间的非翻译区被称为间隔区(intergenicregion，缩写为IGR)。基因组近5′端和近3′端的2个ORFs分别编码合成非结构蛋白(non-structuralprotein)和结构蛋白(capsidprotein)前体，然后进入位于5′端UTRs区和IGR区内的内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysites，缩写为IRES)进行RNA基因组的翻译。反向遗传学主要是针对RNA病毒研究的一项有效工具，是一种体外拯救病毒的有效方法。正常情况下是在质粒中构建通过PCR技术得到的全基因组序列，采用体外转录的手段获得该病毒全基因组RNA全长，将此RNA转染到合适细胞或相应活体能够拯救出具有致病性的病毒，此病毒的质粒称为感染性克隆。通过感染性cDNA克隆，研究人员可以在基因水平对病毒基因组进行各种修饰，通过其病毒的表型来判断对病毒的毒力的影响，从而深入研究病毒的感染特点与致病机制。因此，感染性克隆的构建解决了RNA病毒的众多难题。目前，已有许多RNA病毒的全长感染性克隆被报道，包括很多昆虫的RNA病毒，但是还未见有报道关于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的感染性克隆。
技术实现思路
本专利技术提供一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染性克隆的构建方法，以及该感染性克隆在抗病毒药物筛选方面的应用。本专利技术所构建的蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染性克隆将为深入开展蜜蜂病毒的复制、致病特点、包装机制等基础理论研究以及药物研发、功能评价等应用研究提供有效的技术平台，为保护蜜蜂健康提供有力的技术支撑。本专利技术的目的在于提供一种IAPV病毒感染性克隆pACYC-IAPV，其序列为SEQIDNO.1所示，其中1～640：IAPV-5’UTR序列；641～6493：IAPV病毒非结构蛋白序列；6494～6676：IAPV-IRES序列；6677～9599：IAPV病毒结构蛋白以及3’UTR序列；9600～13235：pACYC177序列；13236～13252：T7启动子序列。本专利技术还有一个目的在于提供了一种IAPV病毒感染性克隆的构建方法，根据本专利技术提供的方法，构建IAPV-BJ2病毒株感染性克隆,并将体外转录的RNA注射到蜜蜂体内，通过荧光定量PCR和免疫印迹实验，可以验证IAPV病毒在蜜蜂体内可以增值并具致病性。本专利技术最后一个目的在于提供了一种IAPV病毒感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用。利用IAPV病毒感染性克隆所拯救出的IAPV病毒对蜜蜂进行感染实验，通过饲喂抗病毒药物，从而计算蜜蜂死亡率可知道药物对病毒的抑制情况。为了达到上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：本专利技术的设计思路为：以低拷贝的载体pACYC177为对象，将IAPV的基因组通过同源重组的方法插入到pACYC177中，同时在病毒5’端非编码区上游引入T7RNA聚合酶的启动子序列，因此IAPV感染性克隆基因组的顺序为：T7-5’UTR-IAPV-3’UTR。此外，T7启动子可以线性化的DNA为模板，在体外高效的转录获得病毒RNA，体外转录出的RNA注射蜜蜂后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。本专利技术上述IAPV感染性克隆的构建方法，其步骤如下：1)IAPV-BJ2病毒株基因组序列分段合成合成IAPV全长基因组的cDNA：选择IAPV-BJ2病毒株序列，GenBank:MG599488.1；分成三个片段进行基因合成，这四个片段分别命名为片段1、片段2和片段3，其中片段1为T7+基因组1-3823nt序列(T7启动子序列与其3’端连接的自GenBank:MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸组成的核苷酸片段)，片段2为基因组3804-6873(自GenBank:MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸片段),片段3为基因组6855-9599nt+A序列(自GenBank:MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸与其3’端连接的A序列组成的核苷酸片段)；T7启动子序列如SEQIDNO.2所示，A序列如SEQIDNO.3所示，三个片段分别用高保真酶通过PCR的方式并进行胶回收得到，经过DNA测序鉴定为正确序列。2)含有病毒基因组的IAPVcDNA感染性克隆的构建(1)IAPV基因组片段将片段1和片段2的拼接：用引物pACYC1905F和IA6820-P1580R通过反向PCR线性化载体pACYC177，引物pACYC1905F的序列为SEQIDNO.4，引物IA6820-P1580R的序列为SEQIDNO.5，，通过同源重组将片段1和片段2连接到载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-6.8k；(2)IAPV基因组全长pACYC-IAPV的拼接：用引物IAPV6840R和引物pACYC1580R通过反向PCR线性化载体pACYC-6.8k，引物IAPV6840R的序列为SEQIDNO.6，引物pACYC1580R的序列为SEQIDNO.7，通过同源重组将片段3连接到线性化的载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IAPV感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种IAPV感染性克隆，其序列为SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，包括下述步骤：
1)IAPV-BJ2病毒株基因组序列分段合成
合成IAPV全长基因组的cDNA：选择IAPV-BJ2病毒株序列，其序列如GenBank:MG599488.1所示；分成三个片段进行基因合成，这三个片段分别命名为片段1、片段2和片段3，其中片段1为T7启动子序列与其3’端连接的自GenBank:MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸组成的核苷酸片段，片段2为自GenBank:MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸片段，片段3为自GenBank:MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸与其3’端连接的A序列组成的核苷酸片段；T7启动子序列如SEQIDNO.2所示，A序列如SEQIDNO.3所示，三个片段分别用高保真酶通过PCR的方式并进行琼脂糖胶回收得到，经过DNA测序鉴定为正确序列；
2)含有病毒基因组的IAPVcDNA感染性克隆的构建
(1)IAPV基因组片段将片段1和片段2的拼接：用引物pACYC1905F和引物IA6820-P1580R通过反向PCR线性化载体pACYC177，引物pACYC1905F的序列为SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯春生，邓帅，杨卅，代平礼，吴艳艳，王强，刁青云，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11