【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品医药检测，具体地说，涉及一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法。
技术介绍
1、蜂王浆（royal jelly）又称蜂皇浆，是年轻工蜂出生后第5至14天由咽下腺和上颚腺分泌的浆状物质，是工蜂幼虫和蜂王一生的食物，短暂食用蜂王浆的工蜂寿命约为35天，而终生食用蜂王浆的蜂王寿命可达1-5年[1]。蜂王浆中水含量约为60%-70%，粗蛋白质含量约为12%-15%，总糖含量约为10%-16%，脂类含量约为3%-6%，另外还有维生素、盐、成熟氨基酸等物质[2]。蜂王浆具有多种生物学活性，是一种适宜人类保健的天然食品[3]。大量研究表明，蜂王浆具有免疫调节作用，有助于延缓天然免疫衰老[4]，蜂王浆中特有的脂肪酸10-羟基-2-癸烯酸(10-hda)对于免疫低下的治疗具有潜在作用并且能有效增强抗原特异性免疫应答[5,6]。另外，蜂王浆还有较强的抗菌活性及抗衰老作用[7]。与此同时，蜂王浆处理可显著改善由高脂饮食引起的葡萄糖稳态失调和炎症反应，具有抗糖尿病，抗肥胖活性[8]。
2、蜜蜂吸食花蜜和花粉来制造蜂王浆，当外界气候条件或蜜粉源条件不利时，蜂农们通常使用人工饲料给蜂群提供营养，常用的饲料包括蔗糖、豆粉、花粉等。同时，使用人工饲料喂养也可以提高产量，降低饲养成本[9]。国际化标准组织（iso）发布的《蜂王浆》国际标准将经不同饲喂方式所生产的蜂王浆分为两类：类型1蜜蜂仅食用天然食物（花粉、花蜜和蜂蜜）；类型2蜜蜂食用天然食物和其它营养物质（蛋白质、碳水化合物等）并指出两种类型蜂王浆的δ13c值（c13/c
3、现有的研究报道中鉴别饲喂蜂王浆的方法为糖含量的分析测定和δ13c值的测定。这两种方法主要针对外源糖饲喂蜂王浆的鉴别，而蜜蜂饲料中不仅含有碳水化合物，还包括蛋白质，目前主要应用的蛋白质源为豆粉。wytrychowski marine等人[11]的研究表明，外源糖饲喂蜂王浆的蔗糖、吡喃糖基蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖的含量以及δ13c值均高于天然饲喂蜂王浆。其中甘蔗或甜菜饲喂获得的蜂王浆蔗糖含量最高可达7.7%，吡喃糖基蔗糖含量高达1.7%，谷物和玉米淀粉水解物饲喂获得的蜂王浆麦芽糖含量为1.4%-5.5%，麦芽三糖含量为0.3%-1.7%；蔗糖或玉米水解物饲喂获得的蜂王浆δ13c值高达-17‰。糖含量的分析测定和δ13c值的测定仅能鉴别是否饲喂碳水化合物，而饲喂蛋白质对测定结果没有影响。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法。
2、为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，采用含0.1 v/v %甲酸的80%乙腈水溶液提取蜂王浆样品中的金雀异黄酮，以金雀异黄酮-氘4为内标物质，利用液相色谱串联质谱法对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否给蜜蜂饲喂了豆粉饲料。
3、本专利技术中，金雀异黄酮（4',5,7-三羟基异黄酮）的结构式见图1a，金雀异黄酮-氘4的结构式见图1b。
4、进一步地，所述方法包括以下步骤：
5、s1.标准溶液配制：用甲醇配制以下系列的含内标物质的金雀异黄酮标准工作液：0.5 µg/l、1 µg/l、5 µg/l、10 µg/l、20 µg/l、50µg/l；标准工作液中内标物质的含量为10µg/l。
6、s2.供试品溶液制备：取1g蜂王浆，加入1µg/ml的内标中间液200µl，加入2ml 0.1v/v %甲酸水溶液，涡旋1-5min（优选1min）后加入8ml含0.1% v/v甲酸的乙腈，涡旋5-10min（优选5min），将混合溶液置于50ml离心管中，4℃下8000r/min离心5-8min（优选5min）；取3ml上清液转移至emr过滤柱中，重力作用下自然洗脱流出，收集全部洗脱液；取1ml洗脱液加入装有1ml水的离心管中，充分涡旋混合均匀，过0.2µm滤膜，得到供试品溶液；
7、s3.液相色谱串联质谱检测：取系列金雀异黄酮标准工作液、供试品溶液分别进样，以色谱峰面积为纵坐标，以系列金雀异黄酮标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，用标准曲线对样品进行定量。
8、本专利技术中，emr过滤柱内含专有的脂质去除吸附剂，能够在保留目标分析物的情况下实现脂质去除。例如，购自美国agilent公司型号为5982-1010的emr小柱。
9、在本专利技术的一个具体实施方式中，液相色谱串联质谱的检测条件为：
10、液相色谱条件如下：流动相a为0.1v/v%甲酸水溶液，流动相b为甲醇；洗脱条件见表1；agilent poroshell 120 ec-c18色谱柱，2.1 mm×100 mm，2.7 µm，柱温为35℃；流速为0.3 ml/min；进样量为5.0 µl；
11、表1 液相梯度洗脱表
12、
13、质谱条件如下：电喷雾离子源；正离子扫描方式；多反应监测模式；雾化器温度290℃，雾化器流速11 l/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压3500 v，鞘流气温度350℃，鞘流气流速12 l/min。
14、进一步地，质谱检测的金雀异黄酮的母离子为270.9，定量离子为153.0（碰撞能量为35v），定性离子为91（碰撞能量为45v），驻留时间为3ms，传输电压为380v。内标物质金雀异黄酮-氘4的母离子为274.3，定量离子为219.0（碰撞能量为30v），定性离子为154.0（碰撞能量为30v），驻留时间为3ms，传输电压为380v。
15、本专利技术中，金雀异黄酮的回收率为61.92-105.83%，相对标准偏差小于14.37%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
16、鉴别方法：非饲喂和饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量如表2所示，非饲喂蜂王浆样品中均未检出金雀异黄酮，饲喂蜂王浆样品中金雀异黄酮含量为43.2811-278.7793µg/kg。因此，可以用金雀异黄酮的含量差异鉴别饲喂蜂王浆，含量大于方法定量限（0.47µg/kg）即为饲喂（豆粕）蜂王浆。图2a~图2d为本专利技术实例中测定的蜂王浆中金雀异黄酮的特征离子质量色谱图（mrm）。图3a~图3d为金雀异黄酮-氘4的特征离子质量色谱图（mrm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，其特征在于，采用含0.1 v/v%甲酸的80%乙腈水溶液提取蜂王浆样品中的金雀异黄酮，以金雀异黄酮-氘4为内标物质，利用液相色谱串联质谱法对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否给蜜蜂饲喂了豆粉饲料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，液相色谱串联质谱的检测条件为：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，质谱检测的金雀异黄酮的母离子为270.9，定量离子为153.0，定性离子为91。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，金雀异黄酮的回收率为61.92-105.83%，检测限为0.16µg/kg，定量限为0.47µg/kg。
【技术特征摘要】
1.一种基于金雀异黄酮含量鉴别人工饲喂蜂王浆的方法，其特征在于，采用含0.1 v/v%甲酸的80%乙腈水溶液提取蜂王浆样品中的金雀异黄酮，以金雀异黄酮-氘4为内标物质，利用液相色谱串联质谱法对其进行定性和定量分析，根据不同饲喂方式下蜜蜂所生产的蜂王浆中金雀异黄酮的含量差异来鉴别是否给蜜蜂饲喂了豆粉饲料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：金玥，李泓飞，薛晓锋，胡菡，赵文，王鹏，张金振，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：
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