microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开一种microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用，所述一种microRNA抑制剂为双拷贝miRNA粘附分子，由通用直链互补序列、通用茎环序列及2个miRNA结合区序列3部分组成。在构建好的表达载体中含有2个dMAN的表达框架，可以同时转录相同或不相同的两个MAN，载体利用率更高，病毒颗粒的使用量以及毒性更小。在构建方法上，本发明专利技术所述构建dMAN的方法更加经济，只需要合成2对不超过60个碱基的引物，通过2次PCR及其酶切和连接技术便可完成一个包含两个MAN结构miRNA抑制载体的一步克隆构建。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，主要涉及一种microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达 载体及其构建方法和应用。
技术介绍
micorRNA(miRNA)是一类天然存在的长约17~25个碱基的非编码小RNA，广泛存 在于动物、植物、线虫等真核生物中，在生物间具有高度同源性。编码miRNA的基因在核内 经RNA聚合酶转录为初级miRNA(pri-miRNA)，经过Drosha、Dicer等酶作用下进一步加过 成成熟miRNA(maturemiRNA)。成熟miRNA与Ago等相关蛋白形成RISC复合体调控相关蛋 白表达。复合体以成熟miRNA为导向，通过与靶mRNA3'非翻译区（3'-UTR)的特异性结 合，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译，最终导致靶基因的蛋白质合成减少。miRNA广泛参 与从细胞到整体的生命过程、估计超过三分之一的人类基因受其调控，目前已经记录超过2 万条miRNA，其中在人类中发现的miRNA为2042条。大量实验表明，miRNA的异常表达会导 致基因调控改变、最终表现为恶性肿瘤等重大疾病。对于miRNA的功能研究及应用离不开 miRNA的抑制，而目前缺乏经济有效的抑制miRNA的方法，传统的化学合成拮抗物普遍存在 毒性过高、不稳定、造价高、作用时间短等缺点。因此，对于miRNA深入研究及应用，需要一 种能够快速、有效、经济地抑制miRNA方法。 目前关于miRNA的研究内容涉及范围十分广泛，研究包括发育过程，生理反应以 及许多病理学特征。然而，特定miRNA在不同环境中的功能研究还在起步阶段。通过生物信 息学预测，一个miRNA往往能靶向上百个靶基因，而仅仅只有一部分得到了实验验证。在研 究过程中，往往通过过表达或者抑制来验证miRNA-靶基因的相互作用。过表达即导入外源 miRNA前体或类似物可引起系统内特定miRNA大量表达，导致系统内靶mRNA水平的下降，但 高剂量的外源miRNA前体或类似物同样容易使其他研究外的基因表达变化。相对与miRNA 的过表达研究，miRNA的功能丧失（loss-of-function)是更为行之有效的研究方法。目前 miRNA缺失实验的方法主要有三种：基因敲除，反义寡聚核苷酸和海绵体技术。 基因敲除就是将编码miRNA的基因敲除，再观察特定miRNA完全缺失后对表型的 影响。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺 乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。目前用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。Zhao(Cell,ZhaoandRansometal.，2007)的研究发现miR-1 可以 通过作用于Hand-2基因适时关闭其介导的蛋白制造，以促使心脏正常发育。miR-1基因敲 除可敲除可导致一系列心脏形态异常。单独敲除小鼠miR-1-2,保留miR-1-l，可导致50% 的小鼠因发生大的室间间隔缺损而死亡。由于基因敲除需要非常好的实验条件才能进行， 而且成功制作一只特定miRNA基因敲除的模型动物周期很长、耗费的人力物力是大多数研 究者无法承担的，同时，许多miRNA基因有着相同的种子序列，因此miRNA家族中的一个成 员可补偿另一个的损失。若想创建一个将miRNA家族中所有成员都删除的动物模型，难度 相当之大。 反义寡聚核苷酸是经化学修饰的寡聚核苷酸，常用的修饰方法包括2'甲氧化、脱 氧化和脂质化。反义寡聚核苷酸根据目的miRNA的反义序列合成，并经过一定的化学修饰， 增加其化学稳定性，利用转染试剂就可以将其导入研究的细胞或组织内。目前市场上最常 见的反义寡聚核苷酸抑制剂是antagomir，它是由一系列甲基化碱基由硫代连接，并由胆固 醇修饰而成。Roberts等（Nucleicacidsresearch,RobertsandLewisetal.，2011)将 miR-122的反义寡聚核苷酸抑制剂注入受慢性感染C型乙肝病毒的大猩猩体内，发现其病 毒承载量有明显下降。Sage等（TheEMBOjournal,leSageandNageletal.，2007)利用 antagomir抑制miR-221和miR-222来调节革E基因p27kipl，结果促进了肿瘤细胞的增殖。 Tavazoie等（Currentmedicinalchemistry,MoriandShrestha, 1997)利用antagomir 抑制miR-126,促使肿瘤细胞的增殖和分化。经化学修饰的寡聚核苷酸实现了短期分析，在 细胞培养物以及某些动物实验中都获得了成功。不过，对于活体研究，miRNA抑制剂需要重 复注射，使用费用昂贵，另外这个抑制剂由于化学修饰常常引起机体免疫反应，具有较高毒 性。miRNA海绵体是一种基于碱基互补原理构建的含有多个miRNA结合位点的核苷酸 序列，旨在竞争性抑制miRNA功能。当海绵体在系统内大量表达的时候，它能够特异性地 结合一系列拥有同一种子序列的miRNA家族。根据miRNA海绵体的思路，已经衍生出许多 不同类型的结构，如targetmimics(Naturegenetics,ChitwoodandTimmermans, 2007)， decoys(Cellcycle,YangandRutnametal.，2012)，miRNAerasers(RNAEbertand Sharp, 2010)。在这些结构中的miRNA的结合位点可以是完全或不完全互补序列，后者是指 在miRNA互补序列中间人为插入不匹配序列，可以降低Ag〇2介导的内源性核苷酸的切割。 目前miRNA海绵体常应用于研究特定miRNA在不同通路上的分析。Barbato等（Journalof neurochemistry，BarbatoandRubertietal.，2010)人用海绵体在小脑颗粒元有丝分裂 细胞中抑制miR-92的表达，miR-92在神经元分化过程中表达下调。在体外实验的第六天， 导入miRNA海绵体的神经元细胞出现钾氯协同转运蛋白KCC2和响应GABA处理的电化学 变化。同样，huang等（FEBSletters,GaoandWangetal.，2014)下用逆转录病毒包装 miR-204海绵体并转染间充质干细胞，持续抑制能强烈地减少脂肪方向的分化同时增加成 骨方向标志物表达量的增加。miR-144和miR-451在网织红细胞中特异地成簇存在，为了验 证它们在血细胞发育的作用，用不同荧光报告系统针对每个研究的miRNA构建海绵体，并 用慢病毒包装转染。三到四周后用流式细胞仪分析发现两个miRNA在红细胞生成的整个过 程中缺一不可，并且它们时相互独立地作用。目前市场上最有应用价值的海绵体是海绵体 decoys，但存在的问题是制作一个海绵体decoys需要合成一长片段（100~200bp)的DNA 序列，再将其整合到载体中使用，操作过程较为复杂、造价较高，且一个海绵体decoys分子 仅有2个miRNA结合位点。 因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种microRNA抑制剂、 microRNA抑制剂表达载体及其构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种microRNA抑制剂，其特征在于，所述一种microRNA抑制剂为双拷贝miRNA粘附分子，由通用直链互补序列、通用茎环序列及2个miRNA结合区序列3部分组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苟德明，康康，邱惠玲，钟嘉胜，罗兰，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44