一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母构建方法及其融合蛋白技术

本发明专利技术提供了一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤，步骤1：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)抗原蛋白筛选；步骤2：PRRSV抗原蛋白酵母表达载体构建；步骤3：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的构建及筛选；步骤4：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的鉴定，所述PRRSV抗原蛋白基因包括GP2和/或GP5蛋白基因。本发明专利技术还提供了构建的酵母菌株所表达的PRRSV抗原蛋白及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含有GP2/GP5和AGA2蛋白。所述PRRSV抗原蛋白及所述融合蛋白稳定展示于酵母菌株表面，具有与天然蛋白更加接近的蛋白结构和特性，有利于进一步的利用所得蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母构建方法及其融合蛋白
本专利技术属于蛋白表达及制备领域，尤其涉及重组蛋白在酿酒酵母体系的表达。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)又被称为猪神秘病(Mysteryswinedisease，MSD)、猪蓝耳病(Blue-earDisease)、猪地方性流产和呼吸综合征(Porcineepidemicabortionandrespiratorysyndrome，PEARS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一种传染性疾病。患有此疾病的猪会出现高烧、腹泻等症状，患病还会导致母猪流产，新生及断奶后的仔猪则会出现呼吸急促、生长缓慢等现象，死亡率极高。有关PRRS的报道最早出现于1987年的美国。其后，PRRS屡次在欧洲大陆和美洲流行，曾有多个国家暴发过严重疫情，疫情给欧洲养猪业造成了严重损害。朱金海(2019)曾用RT-PCR检测了112份疑似PRRSV感染样品，并对其中部分PRRSV毒株的ORF5和Nsp2基因构建了系统进化树。结果发现近年来不同类型PRRSV毒株均出现了不同程度、不同模式的变异。由于病毒高度变异，原有疫苗效价降低，高致病性猪繁殖与呼吸综合征现已成为我国养猪业的主要威胁之一。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，病毒粒子呈球形或椭球形，直径约为50-60纳米，外观较为光滑。病毒的基因组RNA由核衣壳蛋白包裹。在核衣壳周围，表面糖蛋白(GPs)和膜蛋白插入到脂质双层膜中，形成病毒粒子。PRRSV基因组RNA为正链3’-聚腺苷酸分子，大小约15kb，包含11个已知的开放阅读框(ORFs)。基因组3’端包含8个相对较小的基因，除2型PRRSV的ORF4/ORF5外，这些基因与邻近基因均有5’端和3’端序列的重叠。这些相对较小的基因编码了四种膜相关糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5)，三种非糖基膜蛋白(E、ORF5a和M)，以及一种核衣壳蛋白(N)。GP2a是PRRSV结合细胞受体的重要蛋白，ORF5编码的GP5蛋白是重要的中和性抗原，在不同分离株高变的32-34，38-39，57-59，137，151aa处具有关键中和表位。PRRSV目前有商品化的弱毒活苗及灭活苗，也有DNA及亚单位疫苗的应用报道，但均不能有效控制PRRSV的感染。灭活苗的优势在于制备简单、安全性高，但其诱发机体产生免疫功能的效果较差，需要大量接种、多次接种，而接种量过大又可能引起动物应激反应而对动物产生伤害，因此灭活苗在实际养殖过程中使用并不广泛。弱毒活疫苗则能够迅速诱导动物产生免疫保护，不仅能使机体产生针对同源毒株的免疫作用，还能产生针对异源毒株的免疫效果，同时还有用量小、成本低等优势，在养猪业中被广泛运用。然而弱毒活疫苗也存在着毒性增强和引起病毒基因重组等风险，在具体使用过程中须受到限制。DNA及亚单位疫苗利用真核表达系统，表达PRRSV的主要结构蛋白GP5、M、N，纯化后可对动物进行接种，能够弥补传统疫苗存在的缺陷，但目前DNA及亚单位疫苗的使用还很少，相关技术仍需要科研工作者们进一步的研究和推动。考虑到现有疫苗存在的不足，如何研制新型PRRS疫苗用于规避传统疫苗的风险并作为原有疫苗的补充成为亟待解决的问题。随着分子生物学技术的高速发展，酿酒酵母作为一种真核模式生物被广泛应用，与之相关的研究也逐渐深入。20世纪70年代，科学家们专利技术了营养缺陷型互补筛选法，这种酿酒酵母筛选方法一直沿用至今。1996年，酿酒酵母全部基因组测序完毕，成为第一种完成基因组测序的真核生物。目前，酿酒酵母已是人类了解最全面的真核生物，与之相关的技术也愈发成熟。酿酒酵母本身不含内毒素和特异性病毒，因而具有较高的安全性，现已被美国食品药品监管管理委员会(FDA)认定为安全的基因工程受体系统。酿酒酵母作为真核生物，与大肠杆菌等原核生物相比，其蛋白质折叠和分泌机制更接近哺乳动物细胞。近年来，真核表达系统不断完善。科学家们研制了表达GP5-M蛋白的口服植物疫苗，能够较好地诱导黏膜免疫，且具有调节Th17/Treg及其细胞因子的能力，这对新疫苗的研制提供了启发。酿酒酵母作为合成生物学研究中重要的真核模式生物，可用于研究细胞质膜及细胞器膜蛋白在分子间识别、信号传导、细胞代谢中的过程调控，在物质合成中发挥重要作用。利用酿酒酵母制备的酵母疫苗可作为细菌、病毒、霉菌、钩端螺旋体、寄生虫等病原抗原的有效表达载体，激发多种动物的细胞、黏膜及体液免疫反应。口服酵母疫苗可传递重组蛋白及DNA给肠道M细胞、树突状细胞，进一步激发小鼠、兔、猪、禽类、金鲫、人等的特异性抗体反应。经细胞外分泌或表面展示是提高酿酒酵母外源蛋白表达的常用策略。酵母表面展示技术在抗体的筛选、疫苗的研制等方面具有广泛应用。该技术的基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，融合蛋白诱导表达后，由信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌，通过融合蛋白上含有的酵母细胞壁锚定结构，将外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。外源靶蛋白基因通常与细胞壁锚定序列或与AGA2融合表达。根据外源目的蛋白与酵母细胞壁蛋白的融合部位不同，酿酒酵母表面展示系统主要分为凝集素系统(agglutininsystem)和絮凝素系统(floccufinsystem)。凝集素系统又分为α-凝集素(Agα)系统和a-凝集素(Aga)系统，絮凝素系统则分为絮凝结构域锚定系统和糖基磷脂酞肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定系统。当前已有大量利用酿酒酵母表面展示系统构建的病毒疫苗研制成功，如Dey等和Macreadie等构建的鸡传染性法氏囊病毒疫苗、Allnutt等构建的胰脏坏死病毒疫苗等。Sun等利用酿酒酵母展示技术表达了球虫EtMic-2蛋白并给小鸡口服，服用后小鸡对球虫产生了免疫应答[26]。Han将H5N1的HA蛋白展示在酿酒酵母表面，并以小鼠为动物模型对H5N1HA蛋白表达酿酒酵母菌株的免疫原性进行了研究。利用酿酒酵母展示系统制备的口服疫苗使用方便、无毒无害、成本低廉，能够很好地激发动物的粘膜免疫，且酵母细胞壁表面成分具有口服佐剂的功能，能够提高动物的非特异性免疫，从而增强疫苗的效果。此外，利用酵母表面展示系统制备的疫苗中不携带病毒的全套基因组，因此可有效规避病毒因基因重组而变异的风险。世界范围内频繁暴发的PRRS疫情对国内外养猪产业造成严重威胁，而传统PRRS灭活疫苗存在用量大、效果差的问题，传统减毒活疫苗也具有毒力增强和加剧病毒变异的风险。因此，本课题希望构建能够稳定表达多价PRRSV免疫原蛋白的酿酒酵母菌株，用于制备新型PRRS疫苗，以作为传统疫苗的补充，这有助于更好地应对PRRS疫情，保障养猪业的健康发展。酵母展示PRRS疫苗具备以下优势：不携带全套PRRSV基因组，不引起病毒重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤，/n步骤1：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)抗原蛋白筛选；/n步骤2：PRRSV抗原蛋白酵母表达载体构建；/n步骤3：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的构建及筛选；/n步骤4：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤，
步骤1：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)抗原蛋白筛选；
步骤2：PRRSV抗原蛋白酵母表达载体构建；
步骤3：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的构建及筛选；
步骤4：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的鉴定。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1所述的PRRSV抗原蛋白筛选包括PRRSV抗原蛋白基因的同源性比对，PRRSV抗原蛋白的抗原表位分析，PRRSV抗原蛋白结构的模拟分析的至少一种。


3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2包括：克隆PRRSV抗原蛋白基因；构建酵母表达转录单位；所述酵母表达转录单位包括a-凝集素2(AGA2)基因序列。


4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述酵母表达转录单位包括“启动子-AGA2-PRRSV抗原蛋白基因-终止子”，所述酵母表达转录单位包括的PRRSV抗原蛋白基因为GP2和/或GP5蛋白基因。


5.如权利要求4所述的构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄坤勇，黄金海，
申请(专利权)人：天津牧光生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12