一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种编码PRRSV N抗原的核酸分子及其应用、还提供了一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供的检测试剂盒实用性大，可高通量操作，节约检测成本，使用方便。临床检测结果表明，本发明专利技术以N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法特异性强，为继续研究欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒打下基础。

【技术实现步骤摘要】
一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别是一种编码PRRSVN抗原的核酸分子及其应用、检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSvirus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，其能引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸系统疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症。近年来，由于基因重组导致不断有新毒株(例如NADC30，NADC30-like)出现，使得对PRRS防控的难度增加。根据病毒基因特征和全球范围内流行状况可将PRRSV分为1型(欧洲型)和2型(美洲型)，在我国主要流行的是2型，但是近几年欧洲型在我国的流行的已有苗头，PRRSV基因组长15.2Kb，含有10个开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，相邻开放阅读框之间存在短的重叠序列。其中由ORF7编码的核衣壳蛋白N占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在PRRSV感染猪一周左右即可刺激机体产生特异性抗体，并持续数月之久。自2018年爆发非洲猪瘟后，国内大企业丛国外引进种猪较多，欧洲型蓝耳病毒有可能随之广泛传播，所以，以欧洲型蓝耳病N蛋白为基础原料，建立一种ELISA检测方法，为接下来研究欧洲型蓝耳病打下基础。由于操作相对简便和制备成本低廉，使得大肠杆菌成为体外表达外源基因的首选系统，但表达的外源蛋白大都是以非可溶性的包涵体形式存在，与天然活性蛋白差距甚远，限制了其应用。目前，GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用；Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高；MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端；6×His是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。His-tag有以下几个优点：标签的分子量小，只有0.84KD；His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化；His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。PRRSVN蛋白是一种碱性蛋白，局部亲水性较好，通过调整表达条件和添加促溶标签等方式可以实现大肠杆菌的可溶性表达。综上，有必要提供一种体外可溶性表达PRRSVN蛋白抗原的方法、尤其有必要提供一种检测欧洲型PRRSV抗体效价的试剂盒及检测方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N抗原的核酸分子、一种欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N、一种重组载体、一种用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒以及一种检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的方法。第一方面，本专利技术提供一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N抗原的核酸分子，其核苷酸序列包括与SEQIDNO：1所示序列的同源性至少为70％的序列。在本专利技术一实施例中，所述同源性优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％、98％或100％在本专利技术一实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列还包括His标签、GST标签中的一种或多种。第二方面，本专利技术提供一种欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N，其核苷酸编码序列包括如第一方面所述的核酸分子。在本专利技术一实施例中，本专利技术提供的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N的N端还融合有His组氨酸标签或GST标签。可以理解的是，本领域技术人员可根据溶性表达的需要，添加其他融合标签。可以理解的是，本领域技术人员可根据需要，添加其他常规修饰标签。在本专利技术一实施例中，本专利技术提供的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N由如下方法制备：1)设计PCR引物，对所述的PRRSV-N蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：上游F：CGCGGATCCATGGCCGGTAAAAA，下划线为BamHI酶切位点下游-R：CCGGAATTCTCAATTTGCATCCT，下划线为EcoRI酶切位点；2)PCR扩增；3)利用BamHI和EcoRI分别双酶切PCR产物和PET-32a载体，连接、转化、筛选阳性菌；4)将(1)中的阳性菌转入培养液中诱导表达；5)镍树脂吸附柱纯化，获得所述带His融合标签的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N。优选地，步骤(1)中，所述上游引物和下游引物的浓度各为20μM优选地，步骤(4)中，所述诱导表达采用IPTG作为诱导剂。优选地，步骤(4)中，所述诱导表达时诱导温度为23℃，诱导时间为10-12h。优选地，步骤(5)中，用3倍树脂体积的低浓度咪唑洗涤，用500mmoL/L咪唑洗脱蛋白，用PBST置换咪唑，制得纯度较高对的蛋白。进一步优选地，所述低浓度咪唑溶液的浓度为100mmoL/L。本专利技术以His作为促溶标签，实现了PRRSV-N蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达，诱导表达时采用接近常温地23℃进行，无需特意调整温度，洗涤杂蛋白使用100mmoL/L咪唑，洗脱使用500mmoL/L咪唑，两者浓度相差较大，可纯化地到纯度较高地蛋白，重组蛋白具有良好的免疫反应性，这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。第三方面，本专利技术提供了一重组载体，包含如第一方面所述的核酸分子。优选地，所述重组载体为如第一方面所述的核酸分子插入PET-32a载体的BamHI和EcoRI克隆位点后获得的重组表达载体。第四方面，本专利技术提供了如第一方面所述的核酸分子、如第二方面所述的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或如第三方面所述的重组载体在检测欧洲型猪繁殖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N抗原的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所示序列的同源性至少为70％的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种编码欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N抗原的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列包括与SEQIDNO：1所示序列的同源性至少为70％的序列。


2.一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸编码序列还包括His标签、GST标签中的一种或多种。


3.一种欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N，其特征在于，其核苷酸编码序列包括如权利要求1所述的核酸分子。


4.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的核酸分子。


5.如权利要求1的核酸分子、权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或权利要求4的重组载体在检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。


6.如权利要求1的核酸分子、权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N或权利要求4的重组载体在检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价中的应用。


7.一种用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的试剂盒，其特征在于，其组分包括如权利要求3的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白N。


8.一种检测欧洲型猪繁殖与呼吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，蔡蔚游，陈湘，杨心怡，司广斌，周霞，李锦辉，李根，冯军森，韦柳明，梁文清，陈志飞，陈一波，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44