自扩增性SARS-COV-2RNA疫苗制造技术

本发明专利技术涉及自复制性RNA分子，其包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自扩增性SARS
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COV
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2RNA疫苗


[0001]本专利技术涉及自复制性RNA分子，其包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列和编码SARS
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CoV
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2蛋白抗原的序列。

技术介绍

[0002]冠状病毒(CoV)是属于冠状病毒科(Coronaviridae)的正义单链RNA病毒(Ahmed等，2020)。新出现的SARS
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CoV
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2属于乙型冠状病毒，进一步分为四个谱系(即A
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D)。谱系B包括SARS
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CoV和SARS
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CoV
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2，有大约200个已公布的病毒序列，而谱系C包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS
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CoV)，有超过500个病毒序列(Letko等，2020)。SARS
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CoV
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2的基因组大小为约30KB，与其他冠状病毒一样，它编码多种结构性和非结构蛋白。结构蛋白包括刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。由于SARS
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CoV
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2最近才被发现，因此目前缺乏有关该病毒的可用信息。初步研究表明，基于全长基因组系统发育分析，SARS
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CoV
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2与SARS
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CoV非常相似，并且具有推定的相似细胞进入机制和人类细胞受体使用(Ahmed等，2020)。
[0003]由于SARS
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CoV
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2是一种RNA病毒，它正在通过在全球不同地区不断出现的突变而迅速进化。因此，应密切监测能够改变重要病毒特性(例如传播率或致病能力)的突变。最近，某些突变导致了这些重要病毒参数的改变，产生了目前正在全球传播的三种受关注的变体(Volz等，2021)。第一种受关注的变体B1.1.7起源于英国，在编码刺突蛋白的基因中包含三个关键突变：N501Y、P681H和H69
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V70。该变体与导致更高级别的疾病严重程度和传染性有关(Davies等，2021)。第二种受关注的变体B.1.351首次在南非被鉴定出，并且在刺突蛋白编码区包含三个关键性的取代突变：N501Y、K417N和E484K。该变体的数据表明，由于所述突变使得病毒的传播率增加和/或更容易逃避免疫响应(Tegally等，2021)。目前受关注的最后一种变体P.1起源于巴西，并且在编码刺突蛋白的基因中包含与南非变体相同的关键性突变。因此，与野生型病毒相比，该变体也会导致更高的传播率(Moore和Offit,2021)。随着病毒的不断进化，未来极有可能出现更多的SARS
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CoV
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2变体。
[0004]所有CoV都编码表面糖蛋白，刺突蛋白(spike)，它与宿主细胞受体结合并介导病毒进入。对于乙型冠状病毒，称为受体结合域(RBD)的刺突蛋白的单个区域介导与宿主细胞受体的相互作用。结合受体后，附近的宿主蛋白酶会切割刺突蛋白，这释放刺突蛋白融合肽，帮助病毒进入。已知的乙型冠状病毒宿主受体包括SARS
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CoV的血管紧张素转换酶2(ACE2)和MERS
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CoV的二肽基肽酶4(DPP4)(Letko等，2020)。研究表明，SARS
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CoV
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2刺突蛋白与ACE2的结合亲和力高于SARS
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CoV(Zhou等，2020)。此外，核衣壳蛋白(nucleocapsid)也是通过蛋白质低聚化包装病毒基因组的重要亚基(Zhou等，2020)。蛋白质序列比对分析表明，SARS
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CoV
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2在进化上与SARS
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CoV最为保守。具体地，SARS
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CoV
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2的包膜和核衣壳蛋白是两个进化上保守的区域，与SARS
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CoV相比，序列同一性分别为96％和89.6％。然而，刺突蛋白在SARS
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CoV
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2和SARS
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CoV之间表现出最低的序列保守性(序列同一性为77％)。同时，与MERS
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CoV相比，SARS
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CoV
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2的刺突蛋白只有31.9％的序列同一性(Zhou等，2020)。
[0005]近年来，注意力已转向DNA(pDNA)疫苗接种。与更传统的疫苗接种方法相比，DNA疫苗接种的主要优势之一是疫苗抗原是由宿主细胞从头产生的。DNA疫苗能够在动物体内诱导针对多种抗原的有效T细胞和B细胞免疫响应。这最终导致基于质粒DNA的动物用疫苗的开发和商业化(Davis等，2001；Garver等，2005；Kurath等，2006；Grosenbaugh等，2011)。然而，迄今为止，人用DNA疫苗的开发并没有取得同样的成功。虽然许多临床试验证明了DNA疫苗在人体中诱导细胞T细胞和B细胞响应的主要能力，但这些免疫响应的强度远低于通过更传统方法实现的强度。此外，DNA疫苗有若干缺点，例如在非分裂或缓慢分裂细胞中的低效、DNA构建体的表观遗传沉默、抗生素抗性基因的存在和长期不受控制的表达，这些可能不一定与良好的免疫响应相关，甚至可能对预期的免疫效应不利并导致T细胞耗尽(Wherry等，2003；Shin和Wherry,2007；Han等，2010)。对DNA疫苗在人类中“表现不佳”的不同解释可能是这些疫苗的比假定的更弱的佐剂性。细胞质DNA传感器在诱导DNA依赖性免疫响应中的重要性最近得到越来越多的认可(Aoshi等，2011；Marichal等，2011；Desmet和Ishii，2012)。可以想象，如果没有复杂的传递方法的帮助，细胞质中可能没有足够的DNA，或者这些传感器对DNA刺激的敏感性存在物种差异(Kallen和Theβ，2014)。
[0006]因此，研究人员转向了RNA(mRNA)疫苗的应用。利用了转染的细胞的机制来将信息在体内翻译成相应的蛋白质，这是具有药理学活性的产物。IVT mRNA药效学活性的主要区室是细胞质。与在细胞核中产生并通过核输出进入细胞质的天然mRNA不同，IVT mRNA必须从细胞外空间进入细胞质。一旦IVT mRNA进入细胞质，其药理学受调节天然mRNA稳定性和翻译的相同复杂细胞机制支配。从IVT mRNA翻译而来的蛋白质产物经过翻译后修饰，该蛋白质是生物活性化合物。IVT mRNA模板和蛋白质产物的半衰期是基于mRNA的疗法的药代动力学的关键决定因素。对于免疫治疗方法，编码蛋白的加工途径对于确定其药效学至关重要。与内源性产生的蛋白质的命运类似，mRNA编码的产物被蛋白酶体降解，并在主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上呈递给CD8+T细胞。一般来说，细胞内蛋白不会到达MHC II类加工途径来诱导T辅助细胞响应。然本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合，所述组合包含编码SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原的序列和编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白抗原的序列，其中，所述编码SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原的序列和所述编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白抗原的序列包含在一种或多种自复制性RNA分子中，并且其中所述一种或多种自复制性RNA分子还包含编码非结构性甲病毒蛋白的序列。2.根据权利要求1所述的组合，其中，所述编码SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原的序列和所述编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白抗原的序列包含在相同的自复制性RNA分子中，或者其中所述编码SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原的序列和所述编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白抗原的序列包含在不同的自复制性RNA分子中。3.根据权利要求1或2所述的组合，其中，所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)，例如TC
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83毒株或与其具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少97％序列同一性的毒株。4.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述一种或多种自复制性RNA分子包含5
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UTR中的A3G突变和/或非结构蛋白2(nsP2)中的Q739L突变。5.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述刺突蛋白抗原是包含受体结合域(RBD)的刺突蛋白的截短形式。6.根据权利要求5所述的组合，其中，所述RBD对应于SEQ ID NO：1或与其具有至少95％同一性、优选至少97％序列同一性、更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。7.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述一种或多种自复制性RNA分子包含VEEV TC
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83毒株的非结构蛋白、5
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UTR中的A3G突变和nsP2中的Q739L突变。8.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述编码SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原的序列包含：5
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帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原或包含受体结合域(RBD)的刺突蛋白的截短形式的序列，以及处于所述SARS
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CoV
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2刺突蛋白抗原或截短形式的下游的poly
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A尾部。9.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述编码SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白(N)抗原的序列包含：5
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帽，随后的编码非结构性甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的序列，亚基因组启动子以及随后的编码SARS
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CoV
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2N蛋白抗原的序列，以及处于所述SARS
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CoV
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2N蛋白抗原的下游的poly
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A尾部。10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的组合以及药学上可接受的载体和/或药学上可接受的载剂。11.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种佐剂。12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，所述药物组合物还包含阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽或阳离子纳米乳液。13.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其中，所述一种或多种自复制性RNA分子被包封在阳离子脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上。14.一种疫苗，所述疫苗包含根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中，所述RNA分
子被包封在阳离子脂质、脂质纳米颗粒、脂质体、脂质卷、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体、多阳离子肽、阳离子纳米乳液和它们的组合中，或者与其结合，或者吸附于其上；并且其中所述疫苗中的所述RNA的有效剂量为0.1μg至100μg。15.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或权利要求14所述的疫苗，其用作药物。16.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或权利要求14所述的疫苗，其用于预防和/或治疗传染性疾病。17.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或根据权利要求14所述应用的疫苗，其用于在受试者中诱导免疫响应。18.权利要求1至9中任一项所述的组合或权利要求10至13中任一项所述的药物组合物或根据权利要求14所述的疫苗，其用于为受试者接种疫苗以抵抗冠状病毒疾病，例如SARS
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CoV、SARS
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CoV
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2或MERS
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CoV。19.根据权利要求15至18中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述RNA的有效剂量为0.1μg至100μg。20.根据权利要求15至19中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述组合、组合物或疫苗通过肌内、皮内或皮下施用。21.根据权利要求15至20中任一项所述应用的组合、药物组合物或疫苗，其中，所述组合、组合物或疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：I，
申请(专利权)人：纪费亚斯疫苗公司，
类型：发明
国别省市：