本发明专利技术公开了一种固定化马来酸顺反异构酶及其制备方法与应用，属于酶学与酶工程技术领域与生物化工领域。本发明专利技术将R5肽段连接在马来酸顺反异构酶的N端，再将R5-MaiA用戊二醛交联，最后用硅反应液将交联后的R5-MaiA进行包埋，完成马来酸顺反异构酶的固定化。用成本低、易操作的方法获得了稳定性高的固定化马来酸顺反异构酶(R5-MI-CLEA-Si)，固定化酶最适反应温度为55℃，最适反应pH为7.7；在55℃条件下固定化酶的半衰期为4h，游离酶的半衰期为0.5h，固定化酶的稳定性是游离酶的8倍，重复催化反应8次后固定化酶的酶活仍能保留75％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于酶学与酶工 程
与生物化工领域。
技术介绍
目前，工业生产富马酸以化学合成法为主，包括糠醛氧化法和顺丁烯二酸酐异构 法等。但是化学合成法需利用石油资源，而石油是不可再生资源促使生产成本增高，并且还 有污染大等缺点。随着技术的发展，以微生物发酵法和酶转化法为主的生物合成法正逐渐 取代化学合成法，但是微生物发酵法会产生大量的发酵副产物，不利于产品的分离提纯。酶 法有转化率高、产物单一、催化pH单一的优点，是工业生产富马酸很有潜力的方法。 酶作为生物催化剂，近年来在食品生产与检测、生物技术等领域受到广泛关注。但 是由于价格昂贵、稳定相差、反应后难以回收等缺点的限制，使其很难被开发和应用，但是 相对于游离酶，固定化酶就具有较高的稳定性、在反应系统中易分离、可重复利用、利于实 现自动化生产等优点。 常规固定化方法有吸附法、共价结合法、包埋法等，在吸附过程中材料与酶分子会 发生多种相互反应，有些反应会使酶分子形成不稳定结构从而使酶失活，物理吸附和共价 交联都能够减少和避免酶的渗漏，但是酶在结合到材料的二维表面后可能导致活性降低甚 至是失活。多聚体酶，例如马来酸顺反异构酶，在解聚后获得的单亚基不具有活性从而使酶 失活，这是多聚体酶在固定化时面临的一个很重要的难题，也是影响固定化效果的重要原 因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种固定化马来酸顺反异构酶的制备方法，是通过交联-包 埋马来酸顺反异构酶，得到固定化酶。 所述交联-包埋马来酸顺反异构酶，是在马来酸顺反异构酶的N端融合SEQID NO. 1所示核苷酸序列编码的R5短肽，所得重组酶与交联剂交联获得交联酶聚集体，再与硅 化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌，得到固定化酶。 在本专利技术的一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶来源于粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens)〇 在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主，以pET24a为载体，重组表达获 得N端融合有R5短肽的重组马来酸顺反异构酶。 在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主，以pET24a为载体，构建重组表 达N端融合有R5短肽的重组马来酸顺反异构酶的重组菌，培养收集重组菌并破壁后，上清 液经硫酸铵沉淀后用于制备固定化酶。 在本专利技术的一种实施方式中，所述交联剂为10 %的戊二醛。 在本专利技术的一种实施方式中，所述硅化反应液是pH= 8的含0. 1M磷酸氢二钾和 0. 1M氢氧化钠的溶液。 在本专利技术的一种实施方式中，交联酶聚集体与硅化反应液、正硅酸甲酯按体积比 1:8:1混合。 本专利技术的一种实施方式包括以下步骤： 步骤1 :将R5短肽与马来酸顺反异构酶N连接，并构建表达融合蛋白R5_MaiA的 工程菌株； 步骤2 :取步骤1工程菌的发酵液离心去上清后获得菌体，用缓冲液清洗菌体并调 整菌液〇D_= 30-40,超声波破碎后离心取上清； 步骤3 :取步骤2获得的上清，在搅拌的情况下缓慢加入硫酸铵粉末，直到饱和度 达到60%，继续搅拌使马来酸顺反异构酶沉淀； 步骤4 :步骤3完成后，向体系中逐滴加入10 %的戊二醛至终浓度为 0. 05% -0. 2 % (v/v)并于室温下不断搅拌lh，得到交联酶聚集体； 步骤5 :将步骤4获得的交联酶聚集体离心，得到不溶于水的颗粒并用pH8. 4的 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓缓冲液洗涤三次； 步骤6 :步骤5的交联酶聚集体与硅化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌30s，静置 离心后，用缓冲液洗涤得到固定化酶。 本专利技术的一种实施方式包括以下步骤： 步骤1 :将R5短肽与马来酸顺反异构酶N连接，并构建表达融合蛋白R5-MaiA的 工程菌株； 步骤2 :取步骤1工程菌的发酵液离心去上清后获得菌体，用pH8. 4的磷酸氢二 钠-磷酸二氢钾缓冲液洗涤两次，将菌体浓缩到〇D_= 30-40,菌体超声波破碎后12000rpm 离心10min ; 步骤3 :取步骤2获得的破碎上清，在搅拌的情况下缓慢加入硫酸铵粉末，直到饱 和度达到60%，继续搅拌使马来酸顺反异构酶沉淀； 步骤4 :步骤3完成后，向上述体系中逐滴加入10 %的戊二醛至终浓度为 0? 05% -0? 2% (v/v)并于室温下不断搅拌lh; 步骤5 :将步骤4获得的交联酶聚集体离心，得到不溶于水的颗粒并用pH8. 4的 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗涤三次。 步骤6 :步骤5的交联酶聚集体与硅化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌30s，静置 5min，5000rpm离心5min，用pH 8. 4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗绦三次得到固定 化酶。 本专利技术以细胞破碎液为基础进行固定化，相对于其它一些需要纯酶的固定化方 法，不需要对粗酶液进行纯化，减少了纯化过程中的酶量损失，降低了操作复杂度、生产成 本并且节省了时间。本专利技术通过交联剂将酶分子连接在一起形成一个大的聚集体颗粒，能 有效地防止多聚体酶的解聚；融合于酶N端的R5肽段，诱导基于硅沉淀的自包埋过程，可进 一步提高马来酸顺反异构酶的热稳定性。本方法使用的交联与包埋的联合固定化方法大幅 度地提高了马来酸顺反异构酶的热稳定性，相比较于游离粗酶液在55°C下0. 5h的半衰期， 固定化酶在55°C下的半衰期提高到4h;并且固定化酶在重复使用8次后仍然保留了 75% 的初始酶活。本专利技术所得固定化马来酸顺反异构酶在工业化酶法生产富马酸中有良好应用 前景。【附图说明】 图1 :pET24a-R5_MaiA重组质粒酶切验证图谱 M：DNAMarker lOOOObp； 1 :重组质粒pET24a-R5-MaiA的NdeI和HindIII双酶切验证； 2 :重组质粒pET24a-R5-MaiA的NdeI单酶切验证； 3 :重组质粒pET24a-R5-MaiA的HindIII单酶切验证。 图2 :R5-MaiA重组酶表达SDS-PAGE图谱 M :Protein Marker ; 1 :E. coli BL21 (DE3)/pET24a 对照菌破碎上清； 2 :E. coli BL21 (DE3)/pET24a-R5-MaiA 重组菌破碎上清； 3:R5-MaiA 纯酶。 图3 :R5_MaiA固定化酶最适反应温度 图4 :R5_MaiA固定化酶最适反应pH 图5 :重复利用次数对R5-MaiA固定化酶酶活的影响 图6 :固定化酶和游离酶在55°C下酶活性随时间的变化【具体实施方式】 1.酶活检测方法 (1)测定马来酸顺反异构酶活性的反应体系为： 纯酶 10 nL 1mol七1马来酸钾溶液（pH8.4) 50 jxL 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓缓冲液（pH 8 4) 440 uL 总反应体系 500 (iL ⑵测定固定化酶活性的反应体系为： 悬浮状态的固定化酶 100 uL 1mol七1马来酸钾溶液（pH8.4) 500 uL 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓缓冲液（pH 8.4) 4.4 mL 总反应体系 5mL 酶活测定方法：采用HPLC测定产物富马酸，有机酸柱150X4. 6mm5ym;流动相为 25mM磷酸二氢钾pH= 2. 5 ;流速lmL/min;检测波长210nm。柱温40°C。 酶活定义：在37°C的条件下，每分钟转化底物马来酸钾生成1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化马来酸顺反异构酶的制备方法，其特征在于，在马来酸顺反异构酶的N端融合SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的R5短肽，所得重组酶与交联剂交联获得交联酶聚集体，再与硅化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌，得到固定化酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘文茂，周丽，崔文璟，刘中美，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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