一种生产低聚果糖的固定化细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种生产低聚果糖的固定化细胞及其制备方法与应用。制备方法包括以下步骤：(1)向低聚果糖产生菌的菌悬液中加入戊二醛，反应，经洗涤，制得交联菌体；(2)取交联菌体配制交联菌体悬液，然后与固定液混合，将混合后的料液加入到氯化钙溶液中，硬化，固液分离，制得固定化细胞。本发明专利技术首次先采用戊二醛对细胞进行处理，然后用PEG600造孔和海藻酸钙凝胶包埋，并在糖化过程中补充氯化钙，最后获得了酶活稳定性好、传质效率高、连续使用3个月酶活仍高于70％的固定化细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产低聚果糖的固定化细胞及其制备方法与应用，属于细胞固定化

技术介绍
低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)是指果糖基经β-2,1糖苷键连接而成的聚合度为2～9的功能性低聚糖，属于食品配料。按结构，低聚果糖可分为蔗-果型和果-果型两种。工业上生产低聚果糖主要有两种方法：以菊粉为原料的酶水解法和以蔗糖为原料的酶转化法。前者所得低聚果糖聚合度范围较大(DP2-DP9)，属果-果型；后者所得低聚果糖聚合度范围较小(DP3-DP6)，属蔗-果型。研究显示，动物或人体摄食低聚果糖，可改善肠道菌群、减轻便秘症状、改善脂质代谢、抑制肠道腐败、促进钙镁等矿质元素的吸收、增强免疫力等。低聚果糖良好的理化特性和生理功效，使其在食品、保健品、饲料等行业中得到了广泛应用。工业上以蔗糖为原料生产低聚果糖的方法有微生物液体深层发酵法、游离酶法和固定化酶法。微生物液体深层发酵法是一种传统的方法，其生产工艺成熟，是早期低聚果糖生产上通用的方法，该法设备投入较大，且微生物菌体只能利用一次；游离酶法生产工艺简单，但酶只能利用一次且酶制剂成本较高；固定化酶法可实现酶的多次利用，但酶的固定化过程技术要求较高，酶经固定化后转化蔗糖所得低聚果糖的含量往往低于游离酶。除上述生产方法外，尚有固定化细胞法，该法的优点是可实现微生物菌体的重复利用。相比于固定化酶法，该法省去了酶的提取纯化等繁杂的过程，固定化成本较低。固定化细胞法生产低聚果糖，国外有成功的案例，国内鲜有成功应用的报道。中国专利文献CN104450665A(申请号201410720356.2)公布了一种固定红发夫酵母及制备新科斯糖(低聚果糖的一种)的方法及应用。用海藻酸钙凝胶包埋红发夫酵母，所得固定化颗粒经洗涤后，转到壳聚糖溶液中覆膜，所得固定化细胞机械强度和稳定性等得以提高。但是酵母经海藻酸钙包埋后再覆以壳聚糖凝胶，其传质效率降低。中国专利文献CN105112473A(申请号201510649367.0)公开了一种低聚果糖——新科斯糖的生产工艺，该法是利用固定化法夫酵母转化蔗糖来制备新科斯糖。中国专利文献CN101974508A(申请号201010297075.2)公开了一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用，首先在酶液中加入分子筛，其次加入戊二醛使混合液交联，然后经海藻酸钠和氯化钙的包埋，得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。本专利技术所制得的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶具有较高热稳定性和贮存稳定性，同时可采用粗酶液进行固定化，大大降低了固定化的成本，所述固定化酶可用于2-O-葡萄糖基抗坏血酸的生产，转化率高达0.22g·L-1·h-1，转化结束后产物易于提取，固定化酶也便于回收，还可重复利用。但由于该专利固定化的目标为酶，该酶经分子筛吸附与戊二醛交联后，再经海藻酸钙凝胶包埋，传质效率降低；且在应用过程中，凝胶颗粒随着使用次数的增加会逐渐变得松软，给工业化生产带来不便。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种生产低聚果糖的固定化细胞及其制备方法与应用。本专利技术技术方案如下：一种生产低聚果糖的固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)向低聚果糖产生菌的菌悬液中加入戊二醛，制得戊二醛质量浓度为5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm条件下反应6～10h，经洗涤，制得交联菌体；(2)取步骤(1)制得的交联菌体配制菌体浓度为300～500g/L的交联菌体悬液，然后与固定液按质量比0.8～1.2:1混合，将混合后的料液按1:2～5的质量比加入到质量百分比浓度为2～5％的氯化钙溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分离，制得固定化细胞；所述固定液中含有质量百分比浓度为0.5～1.5％的PEG600和质量百分比浓度为3～5％的海藻酸钠。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的低聚果糖产生菌选自黑曲霉或米曲霉。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中菌悬液的菌体质量浓度为5～15g/L。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中低聚果糖产生菌的菌悬液，按如下方法制备：I、将菌株接种于活化培养基中，在温度28～32℃的条件下活化培养66～78h，制得活化菌株；所述活化培养基为PDA培养基，组分如下：马铃薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL，pH自然；马铃薯去皮后切成块，煮沸30min，纱布过滤后加入糖及琼脂，溶化后补水至1000mL，121℃灭菌30min。见沈萍等主编《微生物学实验》第三版(高等教育出版社)215页中的配制方法。II、将步骤I制得的活化菌株接种于种子培养基中，在温度28～32℃、搅拌转速40～90rpm、通气量0.5～2vvm的条件下培养18～24h，制得液体种子；所述种子培养基，组分如下，均为重量百分比：蔗糖4～7％、酵母膏3～5％、玉米粉1～3％，余量水，pH自然；III、将步骤II制得的液体种子按体积百分比8～12％的比例接种于发酵培养基中，在温度28～32℃、搅拌转速40～90rpm、通气量0.5～2vvm的条件下发酵培养24～36h，固液分离，制得菌体；所述发酵培养基，组分如下，均为重量百分比：蔗糖7～10％、酵母膏2～4％、玉米粉0.5～1％，余量水，pH自然；IV、将步骤III制得的菌体与工业用无盐水混合，配制成菌体浓度为5～15g/L的低聚果糖产生菌的菌悬液。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的洗涤方法为：菌悬液过筛、重悬、再过筛，反复3～4次。上述制备方法制得的生产低聚果糖的固定化细胞。上述生产低聚果糖的固定化细胞在制备低聚果糖中的应用。上述应用，包括如下步骤：(a)将生产低聚果糖的固定化细胞填料至高径比为3～6的反应柱中，向反应柱中泵入质量百分比浓度为45～55％的蔗糖溶液进行柱式循环反应，控制流量为4～6BV/h、温度45～55℃、pH5.0～6.5，制得低聚果糖粗液；经检测，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占总固形物质量百分比的56％以上；(b)将步骤(a)制得的低聚果糖粗液稀释至质量浓度为30～35％，经离子交换脱盐，浓缩，制得低聚果糖糖浆。根据本专利技术优选的，所述步骤(a)中，还包括每反应3～5天后向蔗糖溶液中补加氯化钙至质量百分比浓度为0.3～0.5％，进行再硬化10～30h。本专利技术的设计原理专利技术人通过研究发现，生产菌种包埋前，通过特定浓度的戊二醛溶液在一定条件下进行交联反应，可以增强胞内果糖基转移酶的稳定性；同时，在固定化细胞制备过程中，通过添加聚乙二醇进行造孔，提高了固定化颗粒的传质效率；此外，在固定化细胞使用过程中通过补加氯化钙，可以保持固定化细胞颗粒的机械强度，减少由于固定化颗粒松软而造成的菌体损失，从而制得固定化细胞酶活稳定性好、传质效率高，连续使用3个月，酶活仍在70％以上的固定化细胞颗粒。有益效果1、本专利技术首次先采用戊二醛对细胞进行处理，然后用PEG600造孔和海藻酸钙凝胶包埋，并在糖化过程中补充氯化钙，最后获得了酶活稳定性好、传质效率高、连续使用3个月酶活仍高于70％的固定化细胞；2、本专利技术实现了产酶菌体的重复利用，减少了菌种培养的次数，降低了菌种培养过程中的能耗和原料消耗，从而降低生产成本；3、本专利技术在利用固定化细胞生产低聚果糖的过程中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产低聚果糖的固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向低聚果糖产生菌的菌悬液中加入戊二醛，制得戊二醛质量浓度为5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm条件下反应6～10h，经洗涤，制得交联菌体；(2)取步骤(1)制得的交联菌体配制菌体浓度为300～500g/L的交联菌体悬液，然后与固定液按质量比0.8～1.2:1混合，将混合后的料液按1:2～5的质量比加入到质量百分比浓度为2～5％的氯化钙溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分离，制得固定化细胞；所述固定液中含有质量百分比浓度为0.5～1.5％的PEG600和质量百分比浓度为3～5％的海藻酸钠。

【技术特征摘要】
1.一种生产低聚果糖的固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向低聚果糖产生菌的菌悬液中加入戊二醛，制得戊二醛质量浓度为5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm条件下反应6～10h，经洗涤，制得交联菌体；(2)取步骤(1)制得的交联菌体配制菌体浓度为300～500g/L的交联菌体悬液，然后与固定液按质量比0.8～1.2:1混合，将混合后的料液按1:2～5的质量比加入到质量百分比浓度为2～5％的氯化钙溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分离，制得固定化细胞；所述固定液中含有质量百分比浓度为0.5～1.5％的PEG600和质量百分比浓度为3～5％的海藻酸钠。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的低聚果糖产生菌选自黑曲霉或米曲霉。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中菌悬液的菌体质量浓度为5～15g/L。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中低聚果糖产生菌的菌悬液，按如下方法制备：I、将菌株接种于活化培养基中，在温度28～32℃的条件下活化培养66～78h，制得活化菌株；所述活化培养基为PDA培养基，组分如下：马铃薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL，pH自然；马铃薯去皮后切成块，煮沸30min，纱布过滤后加入糖及琼脂，溶化后补水至1000mL，121℃灭菌30min。见沈萍等主编《微生物学实验》第三版(高等教育出版社)215页中的配制方法。II、将步骤I制得的活化菌株接种于种子培养基中，在温度28～32℃、搅拌转速40～...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宗利，李克文，栾庆民，王京博，刘克瑶，贾慧慧，胥九兵，
申请(专利权)人：保龄宝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37