面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，建立了西红花药材质量控制方法，分离出12个主要的西红花苷类成分，以相对稳定、价廉的西红花苷‑Ⅰ为内参物，采用面积归一化法对西红花药材中西红花总苷进行含量测定，解决HPLC法测定西红花药材时多个西红花苷类成分的分离以及含量测定时多个西红花苷对照品不易获得的问题。以西红花苷‑Ⅰ为内参物，建立了西红花苷‑Ⅰ对西红花苷‑Ⅱ的相对校正因子，利用相对校正因子计算西红花苷‑Ⅱ的含量；并与药典采用的外标法测定的32批西红花中西红花苷‑Ⅰ和Ⅱ含量进行比较，以验证一测多评法的可行性。解决了药典测定方法中西红花苷‑Ⅱ对照品性质不稳定、价格昂贵的问题。

Method for determination of saffron and western area safflower glycosides normalization method

The invention discloses a method for the determination of saffron and safflower glycosides in an area normalization method, establish the quality control method of saffron, isolated from the 12 main components of Crocins, to I crocin relatively stable and inexpensive as the internal reference, the Chinese and Western Red saffron total glycosides content determination by area normalization method, solve the separation and determination of HPLC determination of saffron multi glycoside content of saffron and a plurality of crocin control is not easy to get the problem. West of saffloside 1 as the internal reference, set up relative correction factor of crocin crocin II, the content of relative correction factor calculation of crocin II; and the international pharmacopoeia standard method for the determination of the 32 batch of Chinese saffron saffloside I and II were compared to verify the feasibility QAMs method. To solve the determination method of saffloside Chinese Pharmacopoeia II control nature unstable and expensive problem.

【技术实现步骤摘要】
面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法
本专利技术涉及中药活性成分分析
，具体地说，是涉及一测多评法与面积归一化法相结合的测定西红花药材中西红花苷类成分的方法。
技术介绍
西红花(CrocussativusL.)又称藏红花，仅以雌蕊上部三根红色柱头入药，人工采摘100000-150000朵花才能获得一公斤藏红花干品，因此价格昂贵，为名贵中药材，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神之功效。主要有效成分为西红花苷(crocins)，是一种红色的水溶性胡萝卜素类化合物，是西红花酸与葡萄糖或龙胆二糖结合而成的一系列酯苷类，目前已分离得到苷元均为西红花酸的16种不同顺反异构体的西红花苷。世界各地不同来源西红花中均以西红花苷-Ⅰ含量最高，其次为西红花苷-Ⅱ，西红花苷产地栽培、干燥与储存等对西红花苷含量影响很大，因此在西红花生产加工和质量控制方面均需要适当的藏红花苷含量测定方法，《中国药典》2015年版以西红花苷中的西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ为指标对西红花质量控制，要求两者总含量不低于10％，但西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ在某些样品中只占各西红花总苷的70％左右，且随着储存时间的增加，反式的西红花-Ⅰ和苷-Ⅱ会发生降解或异构化，部分转为其他顺式异构体，而西红花苷口服给药后，所有西红花苷均会水解为苷元西红花酸被吸收入血起效，因此西红花总苷含量的高低对药效的影响更大，《中国药典》根据西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的总含量为标准，不能全面反映西红花药材质量；西红花在国际上主要用作色素和香料，作为食品添加剂的国际标准ISO3632-2(2010版)，用分光光度法于λmax440nm测定西红花水提取液的色价来进行质量控制与分级，规定西红花苷色价大于190为一级品，该方法更不能精确定量西红花苷含量。因此，《中国药典》及国际标准ISO3632-2对藏红花质量评价的标准均需进一步完善，需要建立适合生产加工和质量控制的西红花总苷含量测定方法。一般认为分光光度法特征性不强，但西红花是一味很特殊的药材，药效成分均集中于柱头，含量高且相对简单，主要只有藏红花苷、藏花醛和苦藏花素三类成分，在可见光区440nm处只有西红花苷类有吸收，其他成分无干扰，用可见分光光度法(440nm)测定总西红花苷含量的方法，方法简便，易于推广，但该方法只适合生产加工者使用，若有人为掺假等行为，则不适合使用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对《中国药典》仅测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量，不能全面体现总西红花苷的真实含量，《国际标准》测定的总西红花苷色价不能量化总西红花苷的含量的缺点。本专利技术将一测多评测定的两种西红花苷含量和面积归一化法测定的总西红花苷含量相结合，实现了一个对照品完成各西红花苷类成分的含量测定，降低了检测成本，并能全面评价西红花的质量，为西红花药材质量评价方法的完善提供了更好的技术参考。本专利技术采用高效液相法，通过优选色谱条件，波长切换等技术测定药材中的西红花苷，可分离大部分西红花苷类成分，但西红花苷的苷元由七个共轭双键组成，易氧化不稳定，因此西红花苷对照品价格昂贵，精确定量所有西红花苷类成分含量，检测成本非常昂贵，本专利技术使用采用面积归一化法(ANM)对西红花药材中西红花总苷进行含量测定，解决了HPLC法含量测定时多个西红花苷对照品不易获得的问题。本专利技术以西红花苷-Ⅰ为内参物，建立了西红花苷-Ⅰ对西红花苷-Ⅱ的相对校正因子，利用相对校正因子计算西红花苷-Ⅱ的含量(一测多评)；并与药典采用的外标法测定的32批西红花中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量进行比较，以验证一测多评法的可行性。结果西红花苷-Ⅰ相对西红花苷-Ⅱ的相对校正因子重复性好，西红花中西红花苷-Ⅱ的一测多评法的计算值与药典外标法测定结果基本一致，解决了药典测定方法中西红花苷-Ⅱ对照品性质不稳定、价格昂贵的问题。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，包括步骤：a.确定色谱条件；b.制备对照品溶液：混合对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品和西红花苷-Ⅱ对照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合对照品溶液，摇匀，备用；西红花苷-Ⅰ对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西红花苷-Ⅰ对照品溶液；c.制备供试品溶液：参照中国药典2015年版西红花项下，精密称取西红花样品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超声处理20min，放置室温，加乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液；d.根据2015年版中国药典的外标法定量西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；e.一测多评法QMSA测定西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法测定总西红花苷的含量；g.面积归一化法测定总西红花苷的含量。优选地，所述步骤a中，色谱条件为UltimateXBC18色谱柱，色谱柱为250mm×4.6mm,5μm；柱温：30℃；流动相：水-甲醇，梯度洗脱，0-60min，甲醇：20％-100％；DAD检测器波长范围200-600nm，检测波长440nm，流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL。优选地，所述步骤c中，所述冰浴超声为250W、40KHz处理20min。优选地，所述步骤c中，微孔滤膜的孔径为0.22μm。优选地，所述步骤d，进一步为，取步骤b中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的混合对照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按步骤a中色谱条件进样分析，测定峰面积，分别以西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ质量浓度(X,μg)对其相应峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程，精密量取步骤c中的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定，相应峰面积代入回归方程计算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。优选地，所述步骤e，进一步为，取步骤b中混合对照品溶液，分别进样1、2、4、8、10、15、20μL，记录峰面积，应用多点校正法，以西红花苷-Ⅰ为内参物，计算西红花苷-Ⅰ对西红花苷-Ⅱ的相对校正因子fk/s，fk/s计算公式：fk/s＝(Cs×Ak)/(Ck×As)，待测成分(西红花苷-Ⅱ)质量浓度计算公式：Ck′＝(Cs×Ak′)/(fk/s×As)，其中Cs为内参物(西红花苷-Ⅰ)质量浓度，As为内参物色谱峰峰面积，Ck为西红花苷-Ⅱ对照品质量浓度，Ak为西红花苷-Ⅱ对照品色谱峰峰面积，Ck′为西红花样品中西红花苷-Ⅱ质量浓度，Ak′为西红花样品中西红花苷-Ⅱ色谱峰峰面积。优选地，所述步骤f，进一步为，精密吸取西红花苷-Ⅰ对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，以稀乙醇作空白对照，采用紫外-可见分光光度法，于440nm波长处测定吸光度，得标准曲线；精密吸取步骤c中的供试品溶液5mL，置50mL棕色量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，用可见分光光度法于440nm波长处测定吸光度，以西红花苷-Ⅰ为对照标准品，按标准曲线计算总西红花苷含量。优选地，所述步骤g，进一步为，称取西红花样品粉末约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超声(250W，40KHz)处理20min，放置室温，加乙醇定容至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，精密吸取续滤液及步骤b中对照品溶液各10μL，注入液相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，包括步骤：a.确定色谱条件；b.制备对照品溶液：混合对照品溶液：精密称取西红花苷‑Ⅰ对照品和西红花苷‑Ⅱ对照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合对照品溶液，摇匀，备用；西红花苷‑Ⅰ对照品溶液：精密称取西红花苷‑Ⅰ对照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西红花苷‑Ⅰ对照品溶液；c.制备供试品溶液：参照中国药典2015年版西红花项下，精密称取西红花样品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超声处理20min，放置室温，加乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液；d.根据2015年版中国药典的外标法定量西红花苷‑Ⅰ和苷‑Ⅱ的含量；e.一测多评法QMSA测定西红花苷‑Ⅰ和苷‑Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法测定总西红花苷的含量；g.面积归一化法测定总西红花苷的含量。

【技术特征摘要】
1.一种面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，包括步骤：a.确定色谱条件；b.制备对照品溶液：混合对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品和西红花苷-Ⅱ对照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合对照品溶液，摇匀，备用；西红花苷-Ⅰ对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西红花苷-Ⅰ对照品溶液；c.制备供试品溶液：参照中国药典2015年版西红花项下，精密称取西红花样品粉末，置于棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超声处理20min，放置室温，加乙醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液；d.根据2015年版中国药典的外标法定量西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；e.一测多评法QMSA测定西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；f.紫外分光光度法测定总西红花苷的含量；g.面积归一化法测定总西红花苷的含量。2.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤a中，色谱条件为UltimateXBC18色谱柱，色谱柱为250mm×4.6mm,5μm；柱温：30℃；流动相：水-甲醇，梯度洗脱，0-60min，甲醇：20％-100％；DAD检测器波长范围200-600nm，检测波长440nm，流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL。3.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤c中，所述冰浴超声为250W、40KHz处理20min。4.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤c中，微孔滤膜的孔径为0.22μm。5.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤d，进一步为，取步骤b中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的混合对照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按步骤a中色谱条件进样分析，测定峰面积，分别以西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ质量浓度(X,μg)对其相应峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程，精密量取步骤c中的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定，相应峰面积代入回归方程计算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。6.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤e，进一步为，取步骤b中混合对照品溶液，分别进样1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱晓东，周桂芬，姚冲，袁玉梅，李丽琴，余静芬，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33