一种植物干花或干叶中金丝桃苷含量的测定方法技术

本发明专利技术提供一套超高效液相色谱‑电喷雾串联质谱仪对植物干花或干叶中金丝桃苷的含量进行分离测定，灵敏度高、准确性好、样品前处理简捷、省时省力。该方法的建立对植物干花或干叶中黄酮类化合物的分离鉴定及中药材质质量控制具有一定的指导意义。 1

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析检测领域，特别是一种定性和定量检测植物干花和干叶中金丝桃苷的方法。
技术介绍
金丝桃苷广泛存在于多种植物内，譬如金丝桃科、蔷薇科、桔梗科、唇型科、小檗科、杜鹃花科、锦葵科等植物的果实及全草中。金花葵，又名菜芙蓉(Hibiscus manihot L.),为锦葵科秋葵属1年生草本植物，是濒于灭绝的珍稀植物。金花葵与黄蜀葵同属，株高1.5-2m，春种秋收，用种子繁殖，全生育期100多天。金花葵花在200多个秋葵植物中最具有食用、药用、保健等功能，有较高的利用价值。金花葵主要活性成分为生物黄酮,其中稀有黄酮单体金丝桃苷占总黄酮的50％以上。罗布麻是一类重要的野生植物资源，具有极高的药用价值。最早发现于新疆罗布泊，故命名为罗布麻。新疆是罗布麻的主要分布区，分布面积和产量分别占全国的40％和50％。罗布麻富含黄酮类化合物，其中主要为金丝桃苷。《中国药典》中罗布麻以金丝桃苷为质量控制指标，规定本品按干燥品计算含金丝桃苷量不得低于0.30％。黄蜀葵花为锦葵科秋葵属一年或多年生草本植物黄蜀葵的干燥花冠。黄蜀葵通常夏、秋两季开花，花期长，花朵淡黄色且大，观赏性强。作药用常在花盛开时节采摘并及时干燥备用。《中国药典》记载，性味甘、寒，功能清利湿热，消肿解毒。许多研究表明，黄蜀葵花中至少有23个黄酮化合物单体，其中最常见的单体为金丝桃苷、槲皮素，《中国药典》中黄蜀葵以金丝桃苷为质量控制指标，规定本品按干燥品计算含金丝桃苷量不得低于0.5％。贯叶金丝桃为藤黄科一年生草本，花药有黑色腺点，基部连成3束，子房上位，花柱3，分离，顶端5裂。蒴果具背生的腺条及侧和的囊状腺体，顶端开裂，种子多数，圆筒形。花期6-7月。果期10月。《中国药典》中贯叶金丝桃以金丝桃苷为质量控制指标，规定本品按干燥品计算含金丝桃苷量不得少于0.10％。刺玫果为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫的干燥成熟果实,又名野蔷薇果,广泛分布于东北及内蒙、山西等省。文献报道其含有芦丁、金丝桃苷、银锻苷等黄酮类成分。《中国药典》中刺玫果以金丝桃苷为质量控制指标，规定按干燥品计算含金丝桃苷量不得少于0.10％。贯叶连翘为藤黄科多年生草本，秋季采收。药用功效为清热解毒，收敛止血，利湿。治咯血，吐血，肠风下血，外伤出血，风湿骨痛，口鼻生疮，肿毒，汤火伤。贯叶连翘富含黄酮化合物，含量为全株干叶的3.35％-7.4％，其中主要为金丝桃苷及芸香甙。金丝桃苷(Hyperoside,简称Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，其苷元为槲皮素，糖基是吡喃半乳糖，由槲皮素的3位O原子以β糖苷键与糖基相连接。金丝桃苷具有以下作用：1、保肝作用研究发现金丝桃苷对CCL4诱导的大鼠肝损伤具有保护作用，可显著降低模型大鼠血清中的ALT、AST酶活性，降低肝组织匀浆中的MDA含量；显著升高SOD、GSH酶活性；最终减轻CCL4引起的肝组织损伤。2、心脑血管保护作用金丝桃苷可减轻大鼠全脑缺血再灌注后脑水肿程度，缓解海马区自由基代谢异常，改善认知功能。金丝桃苷部分通过激活ERK信号通路来保护H2O2导致的内皮细胞损伤。3、神经系统保护作用金丝桃苷具有明显的抗抑郁作用。4、局部镇痛作用金丝桃苷镇痛效果弱于吗啡,强于阿司匹林,且没有依赖性,是一种新型局部镇痛药物。5、消炎作用大鼠植入羊毛球后,每天20mg/Kg腹腔注射7天,显著抑制发炎过程。金丝桃苷的化学结构式如下：人们利用金丝桃苷这些功效，制作了许多药品和饮品。1、刺五加胶囊以刺五加茎叶提取物为原料的制剂，主要成分为黄酮类化合物，其中金丝桃苷为刺五加叶的主要活性成分。功能主治:活血化瘀。2、心安胶囊由山楂叶提取物制成的制剂，富含黄酮类化合物，其中金丝桃苷为主要成分之一。功能主治:扩张冠状心血管，改善心肌供血量，降低血脂。用于治疗冠心病，心绞痛，胸闷心悸，高血压等。3、郁可欣胶囊由古方研制而成的中药制剂，由贯叶连翘、酸枣仁、合欢皮、石菖蒲等中药组成。主要含有金丝桃苷、槲皮素、槲皮苷、绿原酸、咖啡酸、衣马宁、金丝桃素等成分。功能主治:肝气不舒及情志不畅所致的心神不宁、精神不振、郁郁寡欢等精神抑郁症。4、金花葵花茶完整的金花葵鲜花、花蕾，经低温真空干燥而成。花蕾经开水泡发后，丰富的植物总黄酮，结合维生类与微量元素类营养元素能促进人体全方位的自我调理，从而确保内分泌平衡、抗衰老、抗疲劳、增耐力、促进血液循环加快等功效。金丝桃苷在这些植物中的含量有较多研究，但差异较大。文献统计：贯叶连翘为0.254％-0.266％，菟丝子为0.076-0.102％，江苏江堰黄蜀葵花为1.12％，江苏兴化黄蜀葵花为0.98％，河北邢台黄蜀葵花为1.03％，山楂提取物中为1.95-3.24mg/g，茱萸为0.636-0.682mg/g，罗布麻叶为0.71％，萹蓄为0.011-0.017％，水芹为0.16-0.29mg/g。金花葵中金丝桃苷含量研究较少，且结果相差较大，易剑锋测得宜春学院繁育的金丝桃苷的含量为0.258％，而彭志兵测得同一繁育基地的金丝桃苷的含量为11.25mg/g,即1.125％。差异的原因可能是因为他们所用的检测仪器都是液相色谱仪，灵敏度和准确度均不如液相色谱-串联质谱仪高。随着人民生活水平的提高，人们越来越注重养生，针对这一心理，如今市面上涌现出大量保健品，其中很多保健品都注明含有金丝桃苷成分，《中国药典》中中草药材以金丝桃苷为质量控制指标，含量均有严格的规定。所以准确度高，灵敏度好的检测方法至关重要。现有文献方法除了彭志兵《高效液相色谱-质谱法分析金花葵花中金丝桃苷》使用到质谱仪外，其余五篇文献方法均为液相色谱法。植物样品基质干扰大，部分样品中金丝桃苷含量低，液相色谱法定性差，灵敏度低，难以使人信服，不能作为最终确证方法。质谱分析法是将不同质量的离子按质荷比(m/z)的大小顺序收集和记录下来，得到质谱图，用质谱图进行定性、定量分析及结构分析的方法。质谱先进行一级质谱图全扫描，确定各目标化合物的母离子，然后在选定的源内碎裂电压条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，选取丰度相对最强的1对碎片离子作为定量离子，用于对目标化合物进行定量分析，次强的2对或3对碎片离子作为定性离子，用于对目标化合物进行定量分析。彭志兵《高效液相色谱-质谱法分析金花葵花中金丝桃苷》虽然是用高效液相色谱-质谱法测定金丝桃苷，但只有金丝桃苷的分子离子，并未得到相应的子离子，既无定性离子也无定量离子，所得出的结论一样不能使人信服。超高效液相色谱方法的突出优点体现在节省分析时间和溶剂用量上,尤其对基质复杂的痕量组分测定采用该方法以提高分析通量是今后发展的必然趋势。三重四极杆串联质谱工作原理：化合物分子在真空条件下受电子流的“轰击”或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带正电荷的离子，这些离子按质荷比(m/z)的大小被收集并记录的图谱。电喷雾电离(ESI)：样品溶液在电场的作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂不断挥发而缩小，导致表面电荷密度不断增大，当电荷之间的排斥力足以克服液滴的表面张力时，液滴发生裂分，如此反复进行，最后得到带单电荷或多电荷的离子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定方法，其特征在于：包括下列步骤：a.将植物烘干或晒干，制成干叶或干花，碾成粉末后过40目筛；b.分别准确称取植物干叶或干花粉末两份平行试料各1.00g，加入10mL乙腈水溶液(80:20,v/v)于50mL离心管中，35KHZ超声提取30分钟，10000r/min离心5min，上清液转入另一个50mL离心管中，残渣再加入10mL乙腈水溶液(80:20,v/v)，重复提取一次，合并上清液，提取液于60℃下氮气吹干，用10％甲醇水溶液(10:90,v/v)定容至1.00mL，经0.22nm孔径滤膜过滤后，供超高效液相色谱‑电喷雾串联质谱仪测定；c.测定(1)液相色谱条件色谱柱：Eclipse Plus C18(RRHD 1.8μm，2.1×100mm)流动相：A：纯水，B甲醇流速：0.25mL/min洗脱梯度：0‑0.5min保持10％B,0.5‑5min 10％B线性变化至90％B，5‑5.8min保持90％B，5.8‑6min 90％B线性变化至10％B，6‑8min保持10％B；进样量：5μL(2)质谱条件电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI‑)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3 000V；离子源温度：300℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：4L/min；雾化气压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；d.数据分析和处理。...

【技术特征摘要】
1.一种植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定方法，其特征在于：包括下列步骤：a.将植物烘干或晒干，制成干叶或干花，碾成粉末后过40目筛；b.分别准确称取植物干叶或干花粉末两份平行试料各1.00g，加入10mL乙腈水溶液(80:20,v/v)于50mL离心管中，35KHZ超声提取30分钟，10000r/min离心5min，上清液转入另一个50mL离心管中，残渣再加入10mL乙腈水溶液(80:20,v/v)，重复提取一次，合并上清液，提取液于60℃下氮气吹干，用10％甲醇水溶液(10:90,v/v)定容至1.00mL，经0.22nm孔径滤膜过滤后，供超高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪测定；c.测定(1)液相色谱条件色谱柱：Eclipse Plus C18(RRHD 1.8μm，2.1×100mm)流动相：A：纯水，B甲醇流速：0.25mL/min洗脱梯度：0-0.5min保持10％B,0.5-5min 10％B线性变化至90％B，5-5.8min保持90％B，5.8-6min 90％B线性变化至10％B，6-8min保持10％B；进样量：5μL(2)质谱条件电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI-)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3 000V；离子源温度：300℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：4L/min；雾化气压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；d.数据分析和处理。2.如权利要求1所述的一种植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定方法，其特征在于：所述植物可为罗布麻、黄蜀葵、金花葵中任意一种。3.如权利要求1所述的一种植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定方法，其特征在于：所述数据分析和处理方法如下：试样中金丝桃苷残留量以质量分数X计，数值以微克每千克(μg/kg)表示，单点校正按...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽芳，范芳，周瑶敏，徐俊，廖且根，张金艳，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，
类型：发明
国别省市：江西;36