一种云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的UPLC检测方法技术

本发明专利技术提供了一种云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的UPLC检测方法。上述检测方法，简单、准确、分析时间短、稳定性好，可以用于云南重楼或其多芽品系中甾体皂苷类成分的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及中药材质量检测领域，具体涉及对云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的UPLC检测方法。
技术介绍
《中华人民共和国药典》2015年版一部收载重楼品种为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmithvar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花ParispolyphyllaSmithvar.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效。现代研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血、免疫调节、镇静、镇痛等作用，甾体皂苷成分为发挥作用的主要活性成分。近年来，因重楼市场需求巨大、野生资源濒危及人工繁育技术要求高、栽培周期长等多因素导致重楼价格飙升，从十年前的50元/kg上涨到700～900元/kg。目前重楼人工种植市场上，尚无优质、稳定的种源供给，已成为制约云南白药、宫血宁等著名中成药可持续发展的瓶颈，人工种植重楼日益受到制药企业和种植企业等的高度关注。云南重楼多芽品系，是近几年新发现的一类具有典型的云南重楼植物学特征的新品系，如花瓣上部常扩大为宽2～5mm的狭匙形，药隔凸出部分明显等[1]，但与云南重楼相比其根茎具有众多的丛生芽，每个芽可作为栽培材料，因此，可以快速繁殖和显著增产。高产量和高繁育率的云南重楼多芽品系越来越受重视，但其质量评价却鲜有研究报道。本专利技术希望以UPLC-ELSD法检测出云南重楼(多芽品系)中的多个化学成分，为评价和比较云南省不同栽培地区的云南重楼及多芽品系质量打下基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于首次提供一种对云南重楼多芽品系的质量检测方法。具体地，本专利技术提供了一种云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的UPLC检测方法，它包括如下操作步骤：(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂或含水醇类溶剂提取，合并提取液，除去溶剂后所剩残渣用甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈复溶，制备供试品溶液；(2)取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷中的任意四种或四种以上的甾体皂苷混合物，制备对照品溶液；(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料ELSD检测器条件：漂移管温度55±2℃，氮气压力40±2psi，增益500，冷却模式；流动相：乙腈(A)-水(B)系统，其梯度程序如下：0～1min(5％或10％)～25％A；1～2.5min，25％～30％A；2.5～4min，30％～35％A；4～6min，35％～40％A；6～(8min或9min)，40％～(42％或45％)A；(8或9min)～21min，(42％或45％)～50％A；(21～22～23min，50％～70％～90％A)或者(21～23min，50％A～90％A)；流动相流速0.2mL·min-1；柱温40±2℃。其中，步骤(1)中，醇类溶剂选自甲醇、乙醇或丙醇，含水醇类溶剂选自含水甲醇、含水乙醇或含水丙醇。进一步地，步骤(1)中醇类溶剂选自甲醇或乙醇，含水醇类溶剂选自含水甲醇或含水乙醇。本专利技术一个具体实施方式中，选用甲醇作为提取溶剂。其中，复溶这一步中所用的溶剂可以选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。本专利技术一个具体实施方式中使用甲醇作为溶剂。但是，流动相对待检目标成分同样应具有良好的溶解性能，因此，在实际使用过程中，同样可以使用流动相溶剂——乙腈或含水乙腈进行复溶。其中，提取方式选自超声、浸渍、渗漉或回流。本专利技术一个具体实施方式中，选用超声作为提取方式。当然，本专利技术无论选择何种提取方式，都是以尽量不影响待测样品中目标成分的检测准确度为前提，在实际操作过程中，可以通过本专利技术相同的检测方法来对提取方式进行筛查，其筛查实验即为普通的验证实验，无需付出创造性劳动。本专利技术一个具体实施方式中，步骤(1)中，采用减压蒸发的方式除去溶剂。其中，“减压蒸发”的使用，也是基于尽量不影响待测样品中目标成分的检测准确度为目的，当然，除了这种方法，还可以使用其他的溶剂去除手段，如自然蒸发、低温加热蒸发等。即，除去溶剂的方式为本领域常规的操作手段，可根据实际情况进行选择，不应限于“减压蒸发”。2015年版《中国药典》中，以重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的质量分数作为评价重楼质量指标，然而，本专利技术通过对大量不同产地的云南重楼(主要是多芽品系)研究发现，云南各地区的云南重楼及多芽品系中普遍具有重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷II及重楼皂苷I这4个甾体皂苷，而药典中记载的重楼皂苷VI仅在四份样品中检测到，因此，本专利技术中建议用重楼皂苷H替代重楼皂苷VI或增加重楼皂苷H来评价重楼类药材的质量。基于上述分析，进一步地，步骤(2)中，所述任意四种或四种以上的甾体皂苷混合物中，至少含有重楼皂苷I、II、Ⅶ和H。进一步地，本专利技术还可以取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷中任意5～7种的混合物，制备对照品溶液进行检测，当然，其中至少应含有上述重楼皂苷I、II、Ⅶ和H这4种皂苷。进一步地，步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。其中，步骤(3)中，所述色谱柱填料的粒径为1.7～3.5μm，为1.7～1.8μm，更优选为1.8μm。其中，所述色谱柱尺寸为：2.1×(50mm～100mm)；优选地，所述色谱柱尺寸为：2.1×50mm；进一步优选地，所述色谱柱的型号为：CQUITYBEHC18色谱柱，2.1mm×50mm，1.7μm。其中，流动相：乙腈(A)-水(B)系统，其梯度程序如下之一：梯度程序一：0～1min10％～25％A；1～2.5min，25％～30％A；2.5～4min，30％～35％A；4～6min，35％～40％A；6～8min，40％A～42％A；8～21min，42％A～50％A；21～23min，50％A～90％A；梯度程序二：0～1min5％～25％A；1～2.5min，25％～30％A；2.5～4min，30％～35％A；4～6min，35％～40％A；6～9min，40％A～45％A；9～21min，45％A～50％A；21～22min，50％A～70％A；22～23min，70％A～90％A；梯度程序三：0～1min10％～25％A；1～2.5min，25％～30％A；2.5～4min，30％～35％A；4～6min，35％～40％A；6～8min，40％A～45％A；8～21min，45％A～50％A；21～23min，50％A～90％A。实验表明，上述三种梯度程序能够有效将重楼中的多个化合物有效分离，从而达到进一步检测各成分的目的。而在其他色谱条件下，部分化合物不能在色谱图中有效分离，因此本专利技术优选上述三种梯度程序。另外，本专利技术研究发现，在本专利技术UPLC色谱条件下，可以对云南重楼及其多芽品系中的10余种成分在色谱图中有效分离，且各色谱峰分离度良好，这也有利于对云南重楼及其多芽品系的质量研究与控制，在此基础上，可以使用指纹图谱技术建立云南重楼及其多芽品系的质量检测标准。基于上述实验结果，本专利技术还提供一种云南重楼或其多芽品系的UPLC检测方法，它包括如下操作步骤：(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的UPLC检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂或含水醇类溶剂提取，合并提取液，除去溶剂后所剩残渣用甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈复溶，制备供试品溶液；(2)取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷中的任意四种或四种以上的甾体皂苷混合物，制备对照品溶液；(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料ELSD检测器条件：漂移管温度55±2℃，氮气压力40±2psi，增益500，冷却模式；流动相：乙腈(A)‑水(B)系统，其梯度程序如下：0～1min(5％或10％)～25％A；1～2.5min，25％～30％A；2.5～4min，30％～35％A；4～6min，35％～40％A；6～(8min或9min)，40％～(42％或45％)A；(8或9min)～21min，(42％或45％)～50％A；(21～22～23min，50％～70％～90％A)或者(21～23min，50％A～90％A)；流动相流速0.2mL·min‑1；柱温40±2℃。...

【技术特征摘要】
1.云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的UPLC检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂或含水醇类溶剂提取，合并提取液，除去溶剂后所剩残渣用甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈复溶，制备供试品溶液；(2)取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷中的任意四种或四种以上的甾体皂苷混合物，制备对照品溶液；(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料ELSD检测器条件：漂移管温度55±2℃，氮气压力40±2psi，增益500，冷却模式；流动相：乙腈(A)-水(B)系统，其梯度程序如下：0～1min(5％或10％)～25％A；1～2.5min，25％～30％A；2.5～4min，30％～35％A；4～6min，35％～40％A；6～(8min或9min)，40％～(42％或45％)A；(8或9min)～21min，(42％或45％)～50％A；(21～22～23min，50％～70％～90％A)或者(21～23min，50％A～90％A)；流动相流速0.2mL·min-1；柱温40±2℃。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，醇类溶剂选自甲醇、乙醇或丙醇，含水醇类溶剂选自含水甲醇、含水乙醇或含水丙醇；提取方式选自超声、浸渍、渗漉或回流。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，采用减压蒸发的方式除去溶剂。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述任意四种或四种以上的甾体皂苷混合物中，至少含有重楼皂苷I、II、Ⅶ和H；进一步地，取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷中任意5～7种的混合物，制备对照品溶液。5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述色谱柱填料的粒径为1.7～3.5μm，为1.7～1.8μm，更优选为1.8μm。7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱尺寸为：2.1×(50mm～100mm)；优选地，所述色谱柱尺寸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘圆，张绍山，黄钟杰，余孟杰，
申请(专利权)人：西南民族大学，刘圆，
类型：发明
国别省市：四川;51