本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其制备方法和应用。所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。该酶最适pH为3.5、热稳定性好(最适温度70℃，在60、70℃中处理1h都能保持80％以上的酶活)，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明专利技术的外切多聚半乳糖醛酸酶在饲料、食品行业中，将会比以前报道的外切多聚半乳糖醛酸酶更有应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其基因和应用。
技术介绍
果胶是一类带负电的高分子多糖，广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组织中，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分。果胶由不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接而成的多糖链,常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链,分子量介于25kD～360kD之间。果胶类物质分为4类:原果胶(protopectin)、果胶(pectin)、果胶酸(pectic acid,pectate)和果胶酯酸(pectinic acid,pectinate)。果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称,它能将高分子果胶多糖降解为小分子或单体还原糖形式，能够有效降解果胶，因此果胶酶具有重要的工业应用(Lucie Parenicova et al.,FEBS Letters(2000)467:333-336)。按作用机制果胶酶可以分为原果胶酶、解聚酶和果胶酯酶。解聚酶又可分为果胶水解酶和果胶裂解酶。其中水解酶通过水解作用切割D-半乳糖酸的α-1,4糖苷键生成寡聚半乳糖醛酸，而裂解酶则通过反式消去作用切断α-1,4糖苷键生成β-4,5不饱和半乳糖醛酸，果胶酯酶水解果胶中的甲酯,生成果胶酸(Nilay Demir et al.,Journal of Food Engineering(2001)47:275-280)。多聚半乳糖醛酸链可通过裂解酶和水解酶两种方式进行解聚。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,Endo-/EC 3.2.1.15,Exo-/EC 3.2.1.67)作用于多聚半乳糖醛酸链的α-1,4-d-糖苷键，发生水解反应，产生单个或寡聚的半乳糖醛酸。多聚半乳糖醛酸酶的研究和应用最为广泛(Sharma et al.,Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2013,12:45–60。多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶系中研究最为广泛的酶种，属于糖苷水解酶第28家族，特异催化水解多聚半乳糖醛酸链中α-1,4-糖苷键产生单个或寡聚的半乳糖醛酸，而不能水解甲酯化或乙酰酯化的多聚半乳糖醛酸。与其他糖苷水解酶一样，多聚半乳糖醛酸酶有内切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分，内切多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)的水解产物是寡聚半乳糖醛酸，而细菌和真菌来源的外切多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)的水解终产物有所不同：细菌外切多聚半乳糖醛酸酶水解终产物为半乳糖醛酸；真菌外切多聚半乳糖醛酸酶的水解终产物为二聚半乳糖醛酸。不同来源的多聚半乳糖醛酸酶，酶学性质差异显著。大多数外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH值属于碱性范围，外切多聚半乳糖醛酸酶的最适温度保持在50-60℃的范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种酸性、耐热外切多聚半乳糖醛酸酶。本专利技术的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醛酸酶的编码基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备外切多聚半乳糖醛酸酶的方法。本专利技术的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醛酸酶的应用。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品等行业中应用的新的外切多聚半乳糖醛酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：该酶全长433个氨基酸，N端22个氨基酸为信号肽序列“MKFSNTLTQA ISLLSLGLAV EG”。因此，成熟的外切多聚半乳糖醛酸酶的理论分子量为45.0kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：该外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH为3.5，在pH1.0-pH7.0范围内稳定；最适温度70℃，在85℃时依然具有30％的酶活力，在60处理1h酶活能保持80％以上，70℃中处理1h酶活能保持60％以上，在80℃下处理2min，能够保持60％以上的酶活力，具有良好的热稳定性。本专利技术还提供了编码上述外切多聚半乳糖醛酸酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：其中，信号肽的碱基序列为：“ATGAAGTTCT CCAATACCCT TACCCAGGCA ATCAGCCTGT TGTCTCTGGG CCTCGCCGTG GAAGGG”因此，成熟基因的编码序列为SEQ ID NO.4所示：该酶属于糖基水解酶第28家族，通过比对该酶为一种新的外切多聚半乳糖醛酸酶。本专利技术还提供了包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体，优选为毕赤酵母表达载体。将本专利技术的外切多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将外切多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。本专利技术还提供了包含上述外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株。本专利技术还提供了一种制备外切多聚半乳糖醛酸酶酶的方法，包括以下步骤：1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组外切多聚半乳糖醛酸酶的表达；以及3)回收并纯化所表达的外切多聚半乳糖醛酸酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株。本专利技术还提供了上述外切多聚半乳糖醛酸酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产外切多聚半乳糖醛酸酶。本专利技术从蓝状菌中得到了一个新的外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其编码的外切多聚半乳糖醛酸酶具有以下几个优点：酸性(最适pH为3.5)、热稳定性好(最适温度70℃，在60、70℃中处理1h都能保持80％以上的酶活)，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新专利技术的外切多聚半乳糖醛酸酶在饲料、食品行业中，将会比以前报道的外切多聚半乳糖醛酸酶更有应用价值。本专利技术提供了一个新的外切多聚半乳糖醛酸酶基因，可作应用于饲料、食品等工业。根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的外切多聚半乳糖醛酸酶。附图说明图1外切多聚半乳糖醛酸酶在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析，M.蛋白分子量标准，1纯化的重组酶，2脱糖基后的重组酶。图2本专利技术重组外切多聚半乳糖醛酸酶的最适pH值。图3本专利技术外切多聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。图4本专利技术外切多聚半乳糖醛酸酶最适反应温度。图5本专利技术外切多聚半乳糖醛酸酶热稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9为本公司保存。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶，其特征在于，所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶，其特征在于，所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。2.一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶。3.根据权利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。4.包含权...
【专利技术属性】
技术研发人员：李学军，乔伟，张金伟，陈胜，夏平宇，赵邦红，
申请(专利权)人：北京盛拓达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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