本发明专利技术公开了基于多聚半乳糖醛酸酶Pcipg?8基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法。本发明专利技术基于多聚半乳糖醛酸酶Pcipg?8基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物，由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成。该引物可对不同时期的辣椒疫霉以及不同辣椒疫病材料进行定性、定量分子检测，可对辣椒疫霉初侵染源及其侵染过程各个时期病菌消长动态进行检测与预警，便于及时确定病害最佳防控时期，特别是在病菌早期活动时期适时进行综合防控与治理，如根据对土壤中卵孢子检测的有无及多少，适时处理土壤，阻断源头病菌的繁殖与蔓延，降低了病害防控成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于多聚半乳糖醛酸酶PcipgS基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法。
技术介绍
植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物毁灭性的病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘重要疫病，严重年份乃至绝产。卵菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中度过不良环境并作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，借助雨水或气流传播、侵染而引起植物病害。因此，对该类病菌引起的病害早期进行适时检控，利于控制病害的发生。传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，其中利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异引物，已针对性的开展了大豆疫霉、致病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉分子检测技术研究，但这些技术性研发成果仅能对病菌活动动态进行检测与预警，但不能对病菌致病特性与发生趋势进行检测与预警。研究表明疫霉菌-寄主互作过程中常分泌多种重要的细胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Pg)、果胶甲基酯酶(Pme)、果胶裂解酶(Pel)，这些重要致病因子主要通过降解或软化植物细胞壁的主要成分果胶、中胶层及果胶聚合体，而促使病菌的侵入与定植，对寄主产生寄生与致病性。该类致病酶均由多基因编码，如目前已公开的辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因有 Pcipg 2-3 (GenBank 号分别为DQ415987, DQ415988)，Pcipg5 (GenBank 号为EF558847)。其中少数关键基因是重要的致病靶基因，因此分离鉴定这些重要致病酶的靶标基因，利用基因信息学设计并合成靶标基因的特异引物，针对病菌不同时期致病特性进行分子检测与预警，以便在病菌初侵染期适时采取综合防控措施，减少药剂使用次数及使用量，阻断病菌的扩展与蔓延，控制病害的发生与蔓延。因此，开展重要疫霉菌致病酶类靶标基因克隆及其特异引物设计与合成，研制病菌分子检测、预警技术及其试剂盒，对疫霉病的综合防控具有重要的理论与实践意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种可特异检测辣椒疫霉的PCR引物对(试剂)。本专利技术所提供的特异检测辣椒疫霉的PCR引物对，是多聚半乳糖醛酸酶PcipgS的特异引物对，其名称为ipg8F-R，由序列表中序列I所示的单链DNA(ipgSF)和序列表中序列2所示的单链DNA(ipg8R)组成。其中，序列表中的序列I由21个核苷酸组成，序列2由19个核苷酸组成。含有ipg8F_R的检测或辅助检测辣椒疫霉的PCR试剂盒也属于本专利技术的保护范围，该试剂盒还可含有DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP和dGTP等其它PCR试剂。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测辣椒疫霉的方法。本专利技术所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉的方法，包括如下步骤用待测样品进行PCR，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉或确定待测样品中辣椒疫霉菌的含量。所述待测样品可为土壤或为所述辣椒疫霉的宿主植物的组织和/或器官，如辣椒的叶片、莖、果实等。上述方法中，可按照如下方法确定待测样品中是否含有辣椒疫霉以待测样品的基因组DNA或总RNA反转录得到的CDNA为模板，用ipg8F_R进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物满足下述I)或2)的条件，则所述待测样品含有辣椒疫霉或候选含有辣椒疫霉；若所述PCR扩增产物不满足所述I)或2)的条件，则所述待测样品不含有辣椒疫霉或候选不含有辣椒疫霉；I)所述PCR扩增产物为176bp的片段；2)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为一条100bp_200bp的条带。其中，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉的PCR扩增的条件可为其中，所述PCR扩增的条件可为95°C预变性3min ;94°C变性2min，50°C 30s, 72°C lmin,40个循环。上述方法中，可采用实时荧光定量PCR确定待测样品中辣椒疫霉菌的含量。所述实时荧光定量PCR条件可为95°C预变性2min ;94°C变性30s，55°C退火20s，68°C延伸55s，40个循环。实验结果显示，本专利技术的多聚半乳糖醒酸酶基因Pcipg8的特异引物对ipg8F_R,可对不同时期的辣椒疫霉以及不同辣椒疫病材料(病田土壤、病茎、病果、病叶)进行定性、定量分子检测，可对辣椒疫霉初侵染源及其侵染过程各个时期病菌消长动态进行检测与预警，便于及时确定病害最佳防控时期，特别是在病菌早期活动时期适时进行综合防控与治理，如根据对土壤中卵孢子检测的有无及多少，适时处理土壤，阻断源头病菌的繁殖与蔓延，降低了病害防控成本。附图说明图I为14个Pcipg基因于接种辣椒果实中RNA 转录表达水平qRT_PCR检测结果示意图。图中，横坐标1-14 分别代表 14 个 Pcipg 基因(I Pcipg2, 2 Pcipg 3, 3 Pcipg5,4 Pcipg 8，5 :Pcipg9，6 :Pcipg 10，7 :Pcipgll，8 :Pcipg 12，9:Pcipg 13，10:Pcipg 14，11 :Pcipgl5，12 :Pcipgl6，13 Pcipg 17，14 Pcipg 18)，a，b，c，d 分别代表辣椒疫霉菌接种辣椒果实天数ld、3d、5d、7d。标准误差来自三次重复实验。图2为Pcipg 8基因特异引物对不同参试种菌DNA的PCR检测结果示意图。图中，A为Pcipg 8基因一对特异引物对ipg8F_R对不同种菌DNA的PCR检测结果；BSPcipg5基因一对特异引物对ipg5F-R对不同种菌DNA的PCR检测结果；1 :标准DNA ；2 :阴性对照水；3-7 :辣椒疫霉；8 :大 疫霉；9 :寄生疫霉；10 :致病疫霉；11 :棒疫霉；12 掘氏疫霉；13 :棕榈疫霉；14 :热带疫霉；15 :苎麻疫霉；16 :恶疫霉；17 :苜蓿疫霉；18 :芋疫霉；19 :标准DNA ；20 :隐地疫霉；21 :跳疫霉；22 :早毒疫霉；23 :大雄疫霉；24 :采 疫霉；25 :葱疫霉；26 :冬生疫霉；27 :瓜果腐霉；28 :水霉；29 :甘署根霉；30 :立枯丝核；31 :串珠镰刀菌；32 :腐皮镰孢菌；33 :茄链格孢；34 :青霉菌；35 :淡黄曲霉。图3为Pcipg 8基因特异引物PCR检测辣椒疫霉菌游动孢子DNA结果示意图。图中，A为Pcipg8 —对特异引物对ipg8F_R对不同浓度游动孢子DNA的检测结果；B为参比基因Pcipg5 —对特异引物对ipg5F-R对不同浓度游动孢子DNA的检测结果；1 标准DNA ；2 :阴性对照水；3 :阳性对照辣椒疫霉DNA ;4_19本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张修国，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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