本发明专利技术公开了一种藏羚羊绒及其制品的荧光PCR定性检测方法，包括：第一步，以藏羚羊绒的DNA为模板，进行PCR扩增；第二步，检测扩增产物的荧光信号，以确定是否为藏羚羊绒；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增藏羚羊绒DNA的特异性引物对和探针。本发明专利技术的藏羚羊绒及其制品的荧光PCR定性检测方法不仅特异性好，而且灵敏度高，对于保护藏羚羊、打击违法走私活动具有非常积极的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于PCR检测领域，具体地说，是关于一种藏羚羊绒及其制品的荧光定量PCR定性检测方法。
技术介绍
藏玲羊(Pantholops hodgsonii)是我国特有的珍稀物种之一，属于国家一级保护动物，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》。藏羚羊生活在高寒的可可西里地区，全身覆盖着一层厚厚的毛，其底绒非常细软，直径约10 U m，质地极佳，保暖性好，被称为“shahtoosh”,波斯语羊绒之王的意思。一条重100-150克的Shahtoosh披肩，可以轻易地从一个戒指中穿过，被认为是最上等、最昂贵的时尚，其售价可达数万美元。藏羚羊被喻为“高原的精灵”，自然条件下无法收集其脱落的绒毛。而实际编织这样一条围巾，要消耗300-400克藏羚羊生绒，即3-4头藏羚羊的生命。正是国际市场的追捧和高额利益的驱使，藏羚羊的生命受到了严重的威胁，在20世纪最后20年遭大量偷猎，现存种群数量约7万至10万只。按国家野生动物保护法，猎杀和走私藏羚羊3头即属重大案件，应从重处理，追究刑事责任。近年来，不法分子已经不再将整张羊皮走私出境，而是采取瞒报夹带等更加隐蔽复杂的手法，将藏羚羊绒藏在其他物品中，或混在羊绒、羊毛制品中，将藏羚羊绒运至印度、尼泊尔等地区进行加工，再卖到欧美市场。目前对于藏羚羊绒的鉴别，主要依靠其纤维外观形态，通常使用的仪器设置有光学显微镜，扫描电镜。图1A-1D显示了光学显微镜放大1400倍的藏羚羊毛、藏羚羊绒，及羊绒、细羊毛的纤维纵向形态。由图可见，在相同的放大倍数下，藏羚羊绒的直径比一般的羊绒、细羊毛要细，鳞片呈环状，比较稀疏，与羊绒的表观较为相似，容易混淆。因此，需要有一种更好的方法，能够快速准确地鉴别藏羚羊绒及其制品的方法，从而对保护藏羚羊、打击违法走私活动起到积极的作用。
技术实现思路
本专利技术的首要目的就在于提供一种新的基于DNA检测的藏羚羊绒及其制品的荧光定量PCR定性检测方法。本专利技术的第二个目的在于提供一种藏羚羊绒及其制品的荧光PCR定性检测试剂盒。本专利技术的第三个目的在于提供一种用于检测试剂盒的应用。本专利技术的藏羚羊绒及其制品的荧光定量PCR定性检测方法包括以下步骤第一步，以藏羚羊绒的DNA为模板，进行PCR扩增；第二步，检测扩增产物的荧光信号，以确定是否为藏羚羊绒；其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增藏羚羊绒DNA的特异性引物对和探针。其中，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO. I和2所示；所述特异性探针的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。根据本专利技术的优选实施例，所述PCR扩增的条件如下反应体系为ABITaqman universal PCR master mix (2X) 10 μ 1,DNA模板4 μ I,引物 I. 6 μ 1，探针 2 μ 1，ddH20 2. 4μ I ；反应的条件为:95。0，51^11;951，158，581，458，40个循环。本专利技术提供的藏羚羊绒及其制品的检测试剂盒含有以下试剂(a)扩增藏羚羊绒DNA的特异性引物对；(b)藏羚羊绒DNA的特异性探针。根据本专利技术，所述试剂盒还可以包括(c)标准参照物。其中，所述扩增藏羚羊绒DNA的特异性引物对的序列如SEQ IDNO :1和2所示；所述扩增藏羚羊绒DNA的特异性探针的序列如SEQ IDNO 3所示。本专利技术的藏羚羊绒及其制品的检测试剂盒可用于荧光定性检测藏羚羊绒及其制品O本专利技术的设计的藏羚羊绒实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针及其制成的检测试剂盒，用于检测藏羚羊绒及其制品不仅特异性好，而且灵敏度高，对于保护藏羚羊、打击违法走私活动具有非常积极的作用。附图说明图IA D分别显示了光学显微镜放大1400倍的藏羚羊毛、藏羚羊绒、羊绒、及细羊毛的纤维纵向形态。图2为PCR反应体系的优化结果的示意图。图3显示了藏羚羊引物探针序列与山羊序列的blast结果。图4显示了藏羚羊引物探针序列与绵羊序列的blast结果。图5显示了藏羚羊绒的实时荧光PCR结果。图6显示了 10倍梯度稀释后的实时荧光PCR检测情况，由上而下依次为1，10，IO2,IO3 和 IO4O图7显示了 10倍梯度稀释的实时荧光PCR结果的线性关系。图8显示了不同配比的藏羚羊绒检测情况，由上而下依次为100%、10%和I %。图9为实时荧光PCR产物的部分测序图。具体实施例方式本专利技术通过比较藏玲羊(Pantholops hodgsonii)、山羊(Capra hircus)、及绵羊(Ovis aries)的线粒体12SrRNA基因的序列，选取合适的序列进行了实时荧光PCR扩增的引物和探针的设计，并对PCR反应体系进行了优选。在此基础上，又分别对实时荧光PCR扩增的引物和探针的特异性和灵敏度进行了验证，结果表明，本专利技术设计的实时荧光PCR扩增的引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高。以下结合具体实施例，对本专利技术的藏羚羊绒及其制品的荧光定量PCR定性检测方法作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例I、藏羚羊绒实时荧光PCR扩增的引物和探针设计比较藏玲羊(Pantholopshodgsonii)、山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovisaries)线粒体12SrRNA基因的序列，选取合适的序列进行引物设计。针对藏羚羊线粒体12SrRNA基因的荧光定量PCR产物大小为76bp。引物和探针的序列如下chiruF :5’ -CCCTCCTCAAATAAACATAATGCA-3’ ； (SEQ ID NO. I)chiruR :5’ -TTGTTACGACTTGTCTCCTCTCATG-3’ ； (SEQ ID NO. 2)Pchiru :FAM-TTAAATATACTTACACGCACCCAC-MGB。(SEQ ID NO. 3) 同时设计了藏羚羊、山羊、绵羊共有的通过引物，产物大小为88bp。引物和探针的序列如下GsyF :5’ -GGGTTTACGACCTCGATGTTG-3’ ； (SEQ ID NO. 4)GsyR :5，-ACGTAGGACTTTAATCGTTGAACAAA-3，； (SEQ ID NO. 5)Pgsy :FAM-ACCGCTATCAAAGGTT-MGB。(SEQ ID NO. 6)实施例2、PCR反应体系的优化引物浓度为ΙΟμΜ，探针浓度为2μΜ。反应体系除ABI Taqman universal PCRmaster mix (2X) 10 μ I, DNA模板4 μ I以外,其他成分如表I所示。反应的条件为95°C，5min;95°C，15s，58°C，45s，40 个循环。表I、优化反应体系中其他成分的用量(単位μ I)体系引物探针 ddH2010.4 I4.620.8 I4.231.2 I3.841.6 I3.450.4 23.660.8 23.271.2 22.881.6 22.4优化的结果如图2所示。由图2的结果可见，体系8的荧光信号強度，Ct值最小，故选体系8为扩增藏羚羊绒成分的实时荧光PCR反应体系，即引物终浓度为O. 8 μ M，探针终浓度为O. 2 μ Μ。实施例3、藏羚羊绒成分实时荧光PCR扩增的引物和探针特异性比对与验证3. I、藏本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：费静，唐敏峰，杨娟，董正廉，王卫华，张小明，严安，候颖，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心，中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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