本发明专利技术公开了一种耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4及其克隆的基因epg4、克隆载体、表达载体、重组大肠杆菌、重组毕赤酵母及其在制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4中的应用。所述的内切多聚半乳糖醛酸酶基因epg4经过毕赤酵母表达，纯化后，最适pH值为5.0，最适温度为65℃，并且特异性酶活力高达12,038.1U/mg。rEPG4在pH 3.0‑7.0下25℃处理24h还保持85.9％的酶活力，在50℃和55℃下处理1h之后还分别保持100％和61.2％的酶活力，这说明此酶具有优良的酸稳定性和热稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种能够分解聚半乳糖醛酸或果胶的耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4的应用。
技术介绍
果胶是复杂的多糖聚合体，其结构主要由部分甲酯化的D-半乳糖醛酸聚合而成。果胶是植物中间层和细胞壁的重要组成部分，对促成植物组织结构及稳定性方面起着至关重要的作用(VanBurenetal.,1991)。由于果胶结构的复杂性，所以果胶酶为一个复合酶体系。基于酶的作用类型和对反应底物的偏好性，果胶酶可以分为原果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶(Alkortaetal.,1998)。在这些复合酶中，内切多聚半乳糖醛酸酶能够随机切割果胶聚合体中由非甲酯化的半乳糖醛酸残基所组成的α-1,4糖苷键，从而使高聚合度的果胶发生解聚。这一特性使得内切多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶的最重要组成部分。碱性内切多聚半乳糖醛酸酶主要由细菌产出，并大量应用于造纸、纺织、废水处理、榨油及咖啡和茶叶的发酵。酸性内切多聚半乳糖醛酸酶主要由真菌产出，其主要应用于果蔬和果酒的澄清以及饲料的消化(Kashyapetal.,2001)。当前绝大多数商业果胶酶由黑曲霉产出，并且来源于该菌的几个内切多聚半乳糖醛酸酶已经被报道，这些酶都属于酸性酶，然而在温度高于50℃(Guoetal.,2002.Liuetal.,2014.Singhetal.,2002)，pH低于4.0条件下不稳定(Liuetal.,2014)。不同的生物处理需要不同的生化环境，所以具有耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶，不仅能够提高其催化效率，而且也能够扩展其应用范围。与已经报道的内切多聚半乳糖醛酸酶相比，rEPG4具有高效的催化活性以及优良的酸稳定性和热稳定性，这些特征使得其具有很高的潜在应用价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶，记为rEPG4。所述的耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4含有380个氨基酸，其序列如SEQIDNO.1所示。其中，所述的rEPG4的N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。因此，成熟的rEPG4有361个氨基酸，序列如SEQIDNO.2所示。所述的rEPG4的信号肽序列为SEQIDNO.3所示。本专利技术克隆了这一内切多聚半乳糖醛酸酶基因，克隆得到的内切多聚半乳糖醛酸酶基因记为epg4，DNA全序列分析结果表明：epg4结构基因含有5个内含子，全长1484bp，其序列如SEQIDNO.4所示。所述的rEPG4的cDNA全长1143bp，序列如SEQIDNO.5所示。所述的rEPG4去除信号肽序列后的cDNA序列如SEQIDNO.6所示。其中，所述的rEPG4的信号肽的cDNA序列如SEQIDNO.7所示。含有上述DNA分子的克隆载体、表达载体、重组大肠杆菌或重组毕赤酵母也是本专利技术保护的范围。上述表达载体为在巴氏毕赤酵母Pichiapastoris中表达的pPIC9K载体。本专利技术的表达载体具体为在pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点间插入序列表中SEQIDNO.6核苷酸得到的表达载体pPIC9K-repg4。上述重组毕赤酵母为将所述表达载体pPIC9K-repg4导入巴斯德毕赤酵母中得到的重组菌GS115/rEPG4。上述的DNA分子、克隆载体、表达载体、重组大肠杆菌、或重组毕赤酵母在制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4的方法，所述方法包括以下步骤：1)用pPIC9K-repg4重组载体转化巴斯德毕赤酵母PichiapastorisGS115，筛选得到重组菌株GS115/rEPG4；2)培养重组菌株，甲醇诱导重组内切多聚半乳糖醛酸酶基因epg4的表达；3)回收并纯化所生产的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4。本专利技术的实验证明，本专利技术从草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株CZ1028的基因组序列中发现了一个编码内切多聚半乳糖醛酸酶的基因epg4，可在宿主细胞中表达该基因以生产内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4，用于降解聚半乳糖醛酸或果胶。该酶经过毕赤酵母表达，纯化后，最适pH值为5.0，最适温度为65℃，特异性酶活力高达12,038.1U/mg；在pH3.0-7.0下25℃处理24h还保持85.9％的酶活力，在50℃和55℃下处理1h之后还分别保持100％和61.2％的酶活力，这说明此酶具有优良的酸稳定性和热稳定性，这些特征使得其具有很高的潜在应用价值。附图说明图1：PenicilliumoxalicumCZ1028基因组中含有一个假定内切多聚半乳糖醛酸酶全长基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2：PenicilliumoxalicumCZ1028的一个假定内切多聚半乳糖醛酸酶的cDNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3：PenicilliumoxalicumCZ1028的一个假定内切多聚半乳糖醛酸酶的成熟蛋白质的编码区的cDNA序列的琼脂糖凝胶电泳图。图4：表达载体pPIC9K-repg4的构建。图5：重组巴氏毕赤酵母菌株GS115/rEPG4的菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图6：制备及纯化重组假定内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4的SDS-PAGE分析。图7：纯化的重组假定内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4水解聚半乳糖醛酸的产物的TLC分析。图8：内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4最适作用pH和温度以及pH和温度稳定性分析。具体实施方式1.酶、试剂盒、载体和试剂LATaq酶、pMDTM18-T载体克隆试剂盒、TaqTMHotStartVersion试剂盒、限制性内切酶SnaBI和AvrII、T4DNA连接酶、用于RNA提取的RNAisoPlus及蛋白质分子量标记均购自TaKaRa公司(辽宁，中国)；用于cDNA第一条链合成的反转录试剂盒购自TransGenBiotech公司(北京，中国)；Bradford法蛋白浓度测定试剂盒购自GenerayBiotech公司(上海，中国)；表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司(California,USA)；半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸、橘皮果胶和苹果皮果胶均购自Sigma公司。2.菌株和培养基1)菌株草酸青霉PenicilliumoxalicumCZ1028为本实验室通过诱变筛选得到的高产多聚半乳糖醛酸酶菌株，已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4，其特征在于，其氨基酸序列如
SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。
2.一种克隆了权利要求1所述的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4的基因epg4，其特征在于，
其核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示。
3.包含权利要求2所述DNA分子的克隆载体、表达载体、重组大肠杆菌或重组毕赤酵母。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为在巴氏毕赤酵母
Pichiapastoris中表达的pPIC9K载体，具体为在pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点间插入
序列表中SEQIDNO.6核苷酸得到的表达载体pPIC9K-repg4。
5.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：程忠，陈东，卢波，陆琦，黎贞崇，王青艳，黄日波，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45
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