一种半乳糖‑N‑二糖的制备方法技术

本发明专利技术公开一种半乳糖‑N‑二糖的制备方法，将糖质原料、磷酸化酶、UDP‑葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖‑N‑二糖磷酸化酶、UDP‑葡萄糖差向异构酶、N‑乙酰半乳糖胺和磷酸缓冲液置于同一反应体系中共同作用即可合成目的产物半乳糖‑N‑二糖。本发明专利技术所用原料易得，方法简单，条件温和，制备成本低，适于广泛推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种半乳糖-N-二糖的制备方法
本专利技术涉及寡糖合成领域，具体涉及一种半乳糖-N-二糖的制备方法。
技术介绍
婴儿脱离母体开始吸食母乳后，双歧杆菌迅速在肠道内定植增殖，形成婴幼儿肠道中最重要也是最优势的菌群。双歧杆菌在肠道微生态平衡中起很重要的作用，通过定植于机体肠道黏膜细胞参与机体免疫、营养、消化和保护等一系列生理过程，与机体形成了共生关系，双歧杆菌作为肠道中的优势菌群，具有生物拮抗作用、屏障作用、肝保护作用、营养功能及免疫作用等功能特性。半乳糖-N-二糖(Gal-β1,3-GalNAc)是人体肠道双歧杆菌的重要食物因子。自然界中主要存在于胃粘膜糖蛋白的糖链的基部，或存在于人乳糖蛋白的糖链部分，是糖蛋白中糖链结构的重要组成部分。糖蛋白在双歧杆菌分泌的N-乙酰氨基己糖1-位激酶的作用下可以分解出半乳糖-N-二糖而被双歧杆菌作为其生命活动和代谢的能量源吸收利用，是选择性的促进肠道双歧杆菌增殖的重要益生元。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种半乳糖-N-二糖的制备方法，所制备的寡糖结构为Gal-β1,3-GalNAc，结构式为(I),即半乳糖-N-二糖。本专利技术也可以合成所有含有和/或以半乳糖-N-二糖为骨骼构造的寡糖或多糖。本专利技术采用的技术方案为：一种半乳糖-N-二糖的制备方法，将糖质原料、磷酸化酶、UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶、N-乙酰半乳糖胺和磷酸缓冲液置于同一反应体系中共同作用即可合成目的产物半乳糖-N-二糖。所述的制备方法，所述反应体系的条件：反应温度5-50℃，反应时间20min-1个月。所述的制备方法，所述糖质原料为1-磷酸-葡萄糖、1-磷酸-半乳糖、二磷酸尿核苷葡萄糖、二磷酸尿核苷半乳糖、蔗糖、麦芽寡糖、糊精、淀粉、含纤维二糖、纤维素寡糖、海带寡糖、海带多糖、葡聚糖、糖原中的一种或两种以上组合。所述的制备方法，所述磷酸化酶为蔗糖磷酸化酶、海带二糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶中的一种或两种以上组合。所述的制备方法，所述反应体系中磷酸缓冲液的用量为1μM-2M，pH为3-9。所述的制备方法，所述反应体系中N-乙酰半乳糖胺的用量为1μM-2M。所述的制备方法，所述反应体系中糖质原料的用量为1μM-3.6M。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所合成的寡糖结构为Gal-β1,3-GalNAc，即半乳糖-N-二糖。本专利技术也可以合成所有含有和/或以半乳糖-N-二糖为骨骼构造的寡糖或多糖。本专利技术中所用到的原料有糖质原料、磷酸、磷酸化酶(含蔗糖磷酸化酶、海带二糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶等)、UDP-葡萄糖差向异构酶、UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶和乳糖-N-二糖磷酸化酶。本专利技术中所用到的糖质原料包括1-磷酸-葡萄糖、1-磷酸-半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、二磷酸尿核苷葡萄糖、二磷酸尿核苷半乳糖、蔗糖、麦芽寡糖、糊精、淀粉、纤维素寡糖、海带寡糖、海带多糖、葡聚糖、糖原、以及其他含有(1→3)葡萄糖结合单位或(1→4)葡萄糖结合单位的寡糖或多糖或糖类的衍生物等。糖质的来源没有特别的限制，可以是来源于植物、动物、微生物等自然界，也可以是通过化学或生物的方法人工合成的。本专利技术所用到的酶来源没有特别的限制，可以是自然界的细菌、也可以是酵母和真菌等微生物中提取而得；可以是通过基因重组由基因工程菌生产而得；可以是有自然界的植物组织或动物组织中提取而得。酶的产品形态也无特别限制，可以是固体、粉末、液体、或通过物理或化学的方法固定在载体上的固定化酶；酶可以是市售的商品，也可以是企业或个人自制的产品。本专利技术的合成方法是以蔗糖、淀粉、糊精、葡聚糖等上述的糖质原料的一种或几种的组合，经磷酸化酶分解得到1-磷酸-葡萄糖；磷酸化酶可以是上述酶类中的一种或几种的组合；1-磷酸-葡萄糖与后续的二磷酸尿核苷葡萄糖(或二磷酸尿核苷半乳糖)、UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶和N-乙酰半乳糖胺共同作用合成目的产物半乳糖-N-二糖。所用原料易得，方法简单，条件温和，制备成本低，适于广泛推广应用。本专利技术的合成方法也可以是1-磷酸-葡萄糖、二磷酸尿核苷葡萄糖(或二磷酸尿核苷半乳糖)、UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶和N-乙酰半乳糖胺共同作用合成目的产物半乳糖-N-二糖。本专利技术的合成方法还可以是1-磷酸-半乳糖直接与乳糖-N-二糖磷酸化酶、N-乙酰半乳糖胺共同作用合成目的产物半乳糖-N-二糖。具体实施方式一种半乳糖-N-二糖的制备方法，将1μM-3.6M的糖质原料、磷酸化酶(糖质原料对应的磷酸化酶)、UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶、1μM-3.6M的N-乙酰半乳糖胺和1μM-2M的磷酸缓冲液(pH为3-9)置于同一反应体系中，在反应温度5-50℃下，反应时间20min-1个月，共同作用即可合成目的产物半乳糖-N-二糖。实施例1一种半乳糖-N-二糖的制备方法将500mM的蔗糖、1mM的二磷酸尿核苷葡萄糖、500mM的N-乙酰半乳糖胺、20mM的磷酸缓冲液(pH＝7)、2000U/L的蔗糖磷酸化酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶以及UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶置于同一反应体系中，该反应体系在30℃下反应10天后，即可生成半乳糖-N-二糖。反应液经浓缩、精制、结晶后可得到纯净的半乳糖-N-二糖产品。产品经质谱检测其分子量为383，并经核磁共振检测确认其结构为半乳糖-N-二糖。半乳糖-N-二糖的产率达70％。实施例2一种半乳糖-N-二糖的制备方法将1M的麦芽寡糖、1M的二磷酸尿核苷葡萄糖、1M的N-乙酰半乳糖、500mM磷酸缓冲液(pH＝5)、10000U的固定于琼脂胶载体上的固定化的麦芽糊精磷酸化酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶和UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶置于同一反应体系中，该反应体系在40℃下反应1个月后，即可生成半乳糖-N-二糖。反应液经浓缩、精制、结晶后可得到纯净的半乳糖-N-二糖产品。产品经质谱检测其分子量为383，并经核磁共振检测确认其结构为半乳糖-N-二糖。半乳糖-N-二糖的产率达83％。实施例3一种半乳糖-N-二糖的制备方法将10μM的纤维二糖、1μM的二磷酸尿核苷葡萄糖、10μM的N-乙酰半乳糖胺、1M的磷酸缓冲液(pH＝6)、200U的固定于壳聚糖载体上的纤维二糖磷酸化酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶和UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶置于同一反应体系中，该反应体系在25℃下反应30min后，即可生成半乳糖-N-二糖。反应液经浓缩、精制、结晶后可得到纯净的半乳糖-N-二糖产品。产品经质谱检测其分子量为383，并经核磁共振检测确认其结构为半乳糖-N-二糖。半乳糖-N-二糖的产率达15％。实施例4一种半乳糖-N-二糖的制备方法将0.1％的海带多糖、10mM尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖、200mM的N-乙酰半乳糖胺、100mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半乳糖‑N‑二糖的制备方法，其特征在于，将糖质原料、磷酸化酶、UDP‑葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖‑N‑二糖磷酸化酶、UDP‑葡萄糖差向异构酶、N‑乙酰半乳糖胺和磷酸缓冲液置于同一反应体系中共同作用即可合成目的产物半乳糖‑N‑二糖。

【技术特征摘要】
1.一种半乳糖-N-二糖的制备方法，其特征在于，将糖质原料、磷酸化酶、UDP-葡萄糖己糖磷酸尿苷酰转移酶、乳糖-N-二糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖差向异构酶、N-乙酰半乳糖胺和磷酸缓冲液置于同一反应体系中共同作用即可合成目的产物半乳糖-N-二糖。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系的条件：反应温度5-50℃，反应时间20min-1个月。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述糖质原料为1-磷酸-葡萄糖、1-磷酸-半乳糖、二磷酸尿核苷葡萄糖、二磷酸尿核苷半乳糖、蔗糖、麦芽寡糖、糊精、淀粉、含纤维二糖、纤维素寡糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：李拖平，李苏红，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21