本发明专利技术公开了一种高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863及其编码基因和应用，所涉及的果胶酸裂解酶基因编码序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。该果胶酸裂解酶基因来源于热解纤维素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis，该酶可在70-75℃、pH9.0-9.5以及Ca2+存在条件下高效降解多聚半乳糖醛酸(PGA)和果胶，并且具有较好的温度和pH稳定性。另外，Pel-863对麻纤维、苹果渣及天然秸秆中的果胶质成分均有较好的降解效果，可应用于纺织、造纸及生物能源等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物质利用领域，具体涉及一种高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863及其编码基因和应用。
技术介绍
果胶是一类主要存在于植物初生细胞壁和胞间层的多糖，它与纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使植物组织保持结构完整性和刚性，进而对生物质的抗降解性有重要作用。果胶的分子量一般较大并且结构较为复杂，其基本结构由两大不同结构域组成：线性的同聚半乳糖醛酸区域(homogalacturonan,HG)和分支的鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖区域(rhamnogalacturonan,RG)。HG是由100-200个D-半乳糖醛酸通过α(1,4)糖苷键连接而成的线性同聚物，其中70-80％的半乳糖醛酸残基发生了甲基酯化，也有部分C2和C3位置的羟基发生了乙酰化(Chiliveri&Linga,2014)。RG区域又分为RG-和RG-II两种类型，RG-I的主链是由含半乳糖醛酸和鼠李糖的重复二糖单位构成的，其结构可大致表示为GalAp-α-(1,2)-Rhap-α-(1,4)-GalAp-α-(1,2)-Rhap；RG-II是由HG的主链和11种不同的糖侧链组成的分支型结构，主要有L-阿拉伯糖，D-半乳糖和D-木糖共价连接到主链的C1或C2位置上(Itoh et al.,2006)。果胶的降解涉及多种酶的作用，主要有果胶甲酯酶(pectin methyl esterase,[PME][EC3.1.1.11])，多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,[PG][EC 3.2.1.15])和果胶/果胶酸裂解酶(pectin lyase,[PNL][EC 4.2.2.10]/pectate lyase，[PEL][EC 4.2.2.2])。果胶酸裂解酶是果胶酶中作用方式较为特殊的一类，它通过反式消除方式切割半乳糖醛酸单位间的α(1,4)糖苷键，生成(4,5)不饱和寡聚半乳糖醛酸(Sukhumsiirchart et al.,2009；Wang et al.,2011)。果胶酸裂解酶因其在纺织、造纸、茶或咖啡发酵、果胶废水处理及植物油提取等领域的广泛应用而备受关注(Chiliveri&Linga,2014)。值得一提的是，棉麻等植物纤维应用于纺织之前尤为重要的前处理便是脱胶过程，即去除果胶质及一些杂质。传统的煮碱脱胶法不仅带来严重的环境污染，而且会对纤维本身造成一定的伤害，应用果胶酸裂解酶的生物酶法脱胶在去除非纤维类物质的同时，保持了原纤维的完整性，也大大减少了化学品的消耗，是一种能够替代碱法脱胶的环境友好的方法。同时，由于果胶物质在碱性高温条件下更易溶解，所以嗜热菌或嗜碱菌来源的果胶酸裂解酶具有非常大的工业应用潜质及竞争力。目前发现及研究的果胶酸裂解酶主要来自于芽孢杆菌属、假单胞菌属及曲霉真菌属(Li et al.,2014；Sasaki et al.,2015)。热解纤维素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis是分离自堪察加半岛热泉中的严格厌氧的革兰氏阳性菌，其可在较高温度(45-82℃)下利用纤维素、滤纸以及果胶等物质(Miroshnichenko et al.,2008)。对其基因组分析发现，该菌是迄今发现的具有最高糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolases family)多样性的厌氧嗜热微生物，包含84个GH结构域，分属于38个糖苷水解家族(Blumer-Schuette et al.,2012)。已报道的Caldicellulosiruptor菌属来源的降解酶类如纤维素酶、木聚糖酶、α-葡萄糖醛酸苷酶等均具有较高的作用温度和良好的热稳定性，同时表现出对天然底物的降解优势。本专利技术实现了C.kronotskyensis中果胶酸裂解酶的高效异源表达，该酶的最适温度为70℃，最适pH为9.0，可替代强碱溶液进行麻纤维脱胶，并且可明显促进天然秸秆的降解。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863及其基因工程制备方法和应用，具体包括：1.本专利技术提供一种来源于热解纤维素菌Caldicellulosiruptorkronotskyensis的果胶酸裂解酶Pel-863，该酶属于多糖裂解酶家族3，其编码基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。其中，该酶包含447个氨基酸，N端32个氨基酸为其预测的信号肽序列，即“MSNRKILAIVVSLIMVVSLFTGIGLRNEVAKA”(SEQ ID NO.5)。成熟的果胶酸裂解酶Pel-863的氨基酸序列即为去掉信号肽(SEQ ID NO.5)之后的序列，如SEQ ID NO.4所示，该成熟酶对应的基因序列如SEQ ID NO.2所示。2.本专利技术提供包含上述果胶酸裂解酶基因的重组载体，包括大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、酵母菌表达载体、枯草杆菌表达载体及丝状真菌表达载体等。将本专利技术的高温碱性果胶酸裂解酶基因与线性质粒片段连接获得重组表达载体。重组表达质粒pET-28b-Pel-863作为本专利技术的一个最优选的重组表达载体。3.本专利技术提供包含上述果胶酸裂解酶基因的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌(如Escherichia coli BL 21(DE3)、E.coli Top10、E.coli Rosetta(DE3)等)、乳酸菌(如Lactococcuslactis等)、酵母菌(如Pichiapastoris、Saccharomyces cerevisiae等)、枯草杆菌(如Bacillus subtilis BS168等)和丝状真菌(如Trichodermareesei、Aspergillusniger等)，优选为大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)。4.本专利技术还提供上述果胶酸裂解酶Pel-863的基因工程制备方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体pET-28b-Pel-863转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导果胶酸裂解酶Pel-863的表达；3)回收并纯化所表达的果胶酸裂解酶Pel-863。5.本专利技术还提供上述果胶酸裂解酶Pel-863在酶解多聚半乳糖醛酸、果胶以及苹果渣、麻纤维、玉米秸秆及水稻秸秆中果胶质成分的应用，尤其是在麻纤维脱胶和天然秸秆降解过程中的应用。本专利技术的技术方案:为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：(1)包含上述高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863编码基因的工程菌的构建提取热解纤维素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis的基因组，设计引物扩增Pel-863。得到的目的基因片段和载体经处理后，连接转化宿主细胞。筛选阳性克隆并测序，然后对测序正确的工程菌提取重组质粒，获得重组表达载体。所述表达载体，是指大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、酵母菌表达载体、枯草杆菌表达载体及丝状真菌表达载体等，优选为将本专利技术的高温碱性果胶酸裂解酶基因与线性质粒pET-28b相连接，得到的重组表达质粒pET-28b-Pel-863。将重组表达质粒转化宿主细胞，获得含高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高温碱性果胶酸裂解酶Pel‑863，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。3.权利要求2所述的高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863，其氨基酸序列SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有果胶酸裂解酶活性的衍生蛋白质。4.含有权利要求1所述的高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863的编码基因的重组表达体系，其特征在于：1)扩增权利要求1所述的高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863的编码基因所使用的引物为：Calkro_0863-F 5'-GCCGCGCGGCAGCATGGCGACACT TTTAACA-3'Calkro_0863-R 5'-GCGGCCGCAAGCGTTTAGTATTGATGTATCTGTG-3'2)异源表达权利要求2所述的高温碱性果胶酸裂解酶Pel-863所用的重组载体包括大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、酵母菌表达载体、枯草杆菌表达载体及丝状真菌表达载体等，所对应使用的重组表达菌株为大肠杆菌(如Escherichia coli BL...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩业君，苏红，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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