一种比活提高的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、酶及其应用制造技术

一种比活提高的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌酶及其应用，属于生物工程技术领域。该工程菌的保藏编号为CGMCC No.11461，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2015年9月29日。本发明专利技术主要公开突变型嗜热碱性果胶裂解酶，最适反应温度为70℃，最适Ca2+浓度为0.8mM，底物为0.2％(w/v)多聚半乳糖醛酸，pH 9.5。该酶在最适pH 9.5、Ca2+0.8mM、70℃时酶比活为5300U/mg；在70℃保温下，半衰期为6h；经过镍柱纯化处理后CbPelC-CD可达到40mg/L(1L发酵液)。本发明专利技术所述突变型嗜热碱性果胶裂解酶的比活力相对原酶CbPelC(900U/mg)有大幅度挺高，更加适应现代工业生产要求，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体设及一种比活提高的突变型嗜热碱性果胶裂 解酶基因、工程菌、酶及其在降解果胶物质中的应用。
技术介绍
果胶物质主要由多聚半乳糖醒酸（GalA)组成，并且侧链还常带有海藻糖、鼠李 糖、阿拉伯糖等，广泛存在于植物初生细胞壁中。 果胶酶是一系列分解果胶物质的酶类的总称，在高等植物和微生物中分布甚广。 植物在成熟过程中，果胶酶使植物细胞壁更松软，对植物组织腐败再生平衡也起到了重要 作用。果胶酶按其作用方式的不同可分为两大类，即醋酶和解聚酶，而解聚酶又分为水解酶 和裂解酶。水解酶是通过引入水分子水解糖巧键，而裂解酶是通过反式消去作用断裂糖巧 键。 果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁并导致植物组织 软化甚至死亡的解聚酶，它在果胶降解过程中起着重要的作用。其作用机制是通过β-消 旋的方式作用于断裂糖巧键，形成Δ4, 5不饱和双键，产生不饱和的半乳糖醒酸寡聚糖。果 胶裂解酶也是麻料脱胶工艺和纺织工艺中不可缺少的主要酶类。在医药、生物技术、饲料加 工、环保方面也具有相当地位，在木材防腐和造纸等方面也应用广泛。 目前果胶裂解酶主要W碱性酶为主，而且大多是常溫酶，嗜热酶较少，迄今为止， 关于嗜热纤维素酶的报道很多，而关于嗜热果胶酶的报道很少。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种化Idicellulosiruptorbescii基因来源的突变 型嗜热碱性果胶裂解酶工程菌W及构建方法，所述的突变型嗜热碱性果胶裂解酶工程菌 EscherichiacoliBL21(DE3)/pET20b(+)-PelC-CD，其保藏编号为CGMCCNo. 11461，分类 命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、（CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 100101)，保藏日期为2015年9月29日。 工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋 白，进行分离纯化得到嗜热蛋白，即突变型嗜热碱性果胶裂解酶。 本专利技术制备的突变型嗜热碱性果胶裂解酶的产量可达到40mg/L(lL发酵液），比 活性可达到5300U/mg，相对原酶化1C的900U/mg，PelC-CD是一种比活性很高的碱性果胶 酶，为进一步实现工业化铺垫，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。 本专利技术所述的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌W源于热梭杆菌 CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725的基因为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到 3'端含有6个组氨酸标签的突变型嗜热碱性果胶裂解酶化1C-CD基因（结果相当于截掉嗜 热碱性果胶裂解酶化1C上N末端一段和催化果胶物质分解无关的序列）。其核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示，测序谱图如图1所示。将该突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因化1C-CD连 接到表达载体祀T2化(+)上获得重组表达载体，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中得到突变型嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。 本专利技术所述的突变型嗜热碱性果胶裂解酶工程菌的构建方法参见文献： Overproduction of曰Ik曰line polyg曰1曰cturon曰te ly曰se in recombin曰nt Escherichi曰coli by a two-stage glycerol feeding approach. 2011，Shuying Fang，Jianghua Li， Long Liu，Guocheng Du，Jian Chen. Volume 102,Issue 22,November 2011,Pages 10671 -10678。具体步骤如下： (1)W(^ildicellulosiruptorbesciiDSM6725 全基因组DM为模板，设计引 物，通过PCR反应扩增得到3'端含有6个组氨酸标签基因的突变型嗜热碱性果胶裂解酶 PelC-CD基因；[001引 0)将步骤（1)得到的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC-CD酶切后与 pET20b(+)表达载体连接，得到重组表达载体祀T2化(+) -PelC-CD; (3)将重组表达载体祀T20b (+)-pelC-CD转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL2UDE3)中，构建得到本专利技术所述的突变型嗜热碱性果胶裂解酶工程菌 Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b(+)-PelC-CD。 PCR引物，包括上游引物和下游引物， h游引物：5'GGAATTCCATATGGGTGGTGTTTTAGTTATTACAGATACAATAATTG 3'， 下游引物：5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG3'， 上游引物5'端的CATATG为NdeI酶切位点，保护碱基GGAATTC;下游引物5'端 的CTCGAG为化〇1I酶切位点，保护碱基CCG。 所述的重组表达载体祀T2化(+)-PelC-CD是将突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因 PelC-CD插入到表达载体祀T2化(+)的NdeI和化〇1I位点间得到。 所述工程菌是将重组表达载体导入感受态细胞E.coliBL21 (DE3)得到的。 本专利技术的第二个目的是提供一种应用本专利技术所述的工程菌发酵生产的突变型嗜 热碱性果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。其是将突变型嗜热碱性果胶裂解 酶工程菌接种（接种量2%。~5%。（v/v))至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，37°C、 17化/min振荡培养至0成。。=6. 0,获得种子液；然后将种子液接种至含有50μg/mL氨节的 发酵培养基中，接菌量为2%。~5%。（v/v)，装液量为化/5L(化指的是发酵培养液体积，5L 指的是锥形瓶的容积），于37°C、170r/min振荡培至0成。。=0. 6时加入终浓度0. 5mMIPTG 进行诱导，同时将溫度调整为25~28°C，转速调整为100~12化/min,诱导发酵18~2地， 从而得到工程菌发酵液。通过细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，儀柱亲和层析法得 到突变型嗜热碱性果胶裂解酶。经过儀柱纯化处理后突变型嗜热碱性果胶裂解酶含量可达 至Ij40mg/L(1L发酵液）。 在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终 浓度分别为：膜蛋白腺lOg/L酵母提取物5g/l，化C1lOg/L;培养基的抑值为7. 0-7. 2;发 酵培养基的成份如下：培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度为：膜 蛋白腺lOg/L酵母提取物5g/l，化C1lOg/L;培养基的抑值为7. 0~7. 2; 本专利技术第Ξ个目的是提供所述的突变型嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中 的应用。 在本专利技术应用中，所述果胶物质为多聚半乳糖醒酸。 本专利技术所述突变型嗜热碱性果胶裂解酶，在70°C降解多聚半乳糖醒酸的酶活为 5300U/mg;热稳定较好，在70°C保溫下，半衰期为化；最适反应溫度为70°C，最适Ca2+本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种比活提高的突变型嗜热碱性果胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张作明，李海超，张静，李正强，于擎，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22