异源合成广霍香醇的方法和微生物技术

本发明专利技术涉及生物合成工程与微生物制造技术领域，提供了一种异源合成广霍香醇的方法和微生物。具体地，本发明专利技术提供了微生物异源合成倍半萜广藿香醇的方法，主要包括对广藿香醇合成酶的密码子优化，合成下游途径的组装与表达，微生物宿主萜类合成前体IPP/DMAPP的强化，最终实现广藿香醇在微生物体内的高效合成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物合成工程与生物制造
，具体地提供了一种异源合成广霍 香醇的方法和微生物。
技术介绍
广蕾香醇（Patchoulialcohol)是一种重要的Η环倍半聰类化合物。广蕾香醇又 称百秋李醇，其分子式为。5&诉，分子量为222. 37,结构如图1所示。 天然形式的广霍香醇主要存在于唇形科刺蕊草属植物广蕾香（Pogostemon C油1in度lanco)Benth)的挥发油一广蕾香油中，是广蕾香挥发油的主要成分，是历版《中国 药典》规定的评价广蕾香药材及广蕾香油质量标准的指标性成分。 广蕾香醇单体为无色晶体，有较淡的广蕾香香气，其烙点为55-561：，沸点 28(TC(常压下），相对密度为1. 0284,旋光度-97. 4°(C= 24,氯仿）；不溶于水，溶于醇、 離和常用有机溶剂。广蕾香醇具有独特持久的香味，作为香料的标志性成分被广泛用于日用品和化妆 品中。 近年来，随着科研人员对广蕾香醇研究的深入，广蕾香醇被发现具有很好的神经 保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症、抗锥虫病原体和毒杀白蚁等生物活性。此 夕b现代药理实验表明，广蕾香醇还具有抗氧化等药理活性，有一定的新药开发价值。与大多数植物源天然产物一样，目前广蕾香醇主要通过化学合成和有机溶剂萃取 两种方法制备。作为含有5个手性碳原子的四面体结构，广蕾香醇的化学合成方法过于复杂，且 得率极低。 有机溶剂萃取法主要通过天然的含广霍香醇的植物进行组织抽提来获取广霍香 醇，然而该方法受到植物生长缓慢、广霍香醇含量低、需要消耗有机溶剂等影响。 Joe化appell等通过转基因的方法对烟草进行遗传改造，使得烟草能够合成 0. 5μg/g湿重的广蕾香醇。然而，植物基因工程方法仍具有植物生长缓慢、广霍香醇含量 低、需要消耗有机溶剂等缺点。 由于广蕾香醇具有神经保护、抗流感病毒等作用，并且，广蕾香醇单体在国外日化 产品行业有较成熟的应用基础，而在国内日化产品市场应用仍接近空白，因此，其市场空间 广泛，但亟需可解决其高成本难题的工业化生产方法。 虽然人们尝试开发在微生物中生产广霍香醇的技术，然而迄今为止，尚未有在微 生物中成功地合成广蕾香醇的报道。此外，微生物发酵最大的瓶颈在于如何实现工业化，而 工业化的必要条件是其产量需要满足可W工业化的水平。综上所述，本领域迫切需要开发新的高效、简便、低成本地生产广霍香醇的方法， 尤其是通过微生物制备纯度较高的广霍香醇的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供通过微生物生产广霍香醇的新工艺，实现广蕾香醇更清 洁，更经济的制造。具体来说，本专利技术的目的是提供一种微生物异源合成倍半聰广蕾香醇的 的方法。 在本专利技术的第一方面，提供了一种基因组合，所述的组合包括（i)pts基因的多核 巧酸序列和（ii)ispA基因的多核巧酸序列。 在另一优选例中，所述组合还包括选自下组的一种或多种多核巧酸序列： (a)dxs2基因的多核巧酸序列； 化）idi基因的多核巧酸序列； (c)MVA途径的合成蛋白基因的多核巧酸序列，较佳地所述合成蛋白基因选自： atoB、mvaS、mvaE,mvaKl、mvaK2、mvaD、或其组合。 在另一优选例中，所述的组合由（i)pts基因和m)ispA基因二种基因构成。 在另一优选例中，所述的基因组合用于在植物体外合成广蕾香醇和/或其衍生 物。 在另一优选例中，所述的基因组合为多核巧酸序列和/或载体的组合。 在另一优选例中，所述的基因组合包括： 第一序列，其中所述第一序列含有pts基因的多核巧酸序列；W及 第二序列，其中所述第二序列含有ispA基因的多核巧酸序列。 在另一优选例中，所述的基因组合包括： 第一载体，其中所述第一载体含有pts基因的多核巧酸序列；W及第二载体，其中所述第二载体含有ispA基因的多核巧酸序列。 在另一优选例中，所述的第一载体和第二载体是同一载体（即pts基因的多核巧 酸序列和ispA基因的多核巧酸序列位于同一载体上）。 在另一优选例中，所述的基因的多核巧酸序列包括基因组序列和cDNA序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种构建物，所述的构建物含有第一表达盒和第二 表达盒，其中所述第一表达盒表达pts蛋白；而所述的第二表达盒表达ispA蛋白。 在另一优选例中，所述的构建物用于在植物体外合成广蕾香醇和/或其衍生物。 在另一优选例中，所述的构建物为表达载体。 在另一优选例中，所述的构建物为1个或2个表达载体。 在另一优选例中，第一表达盒从5'至3'依次含有启动子、pts蛋白编码序列、终 止密码子和任选的3' -UTR。 在另一优选例中，第二表达盒从5'至3'依次含有启动子、ispA蛋白编码序列、终 止密码子和任选的3' -UTR。 在另一优选例中，所述的pts蛋白编码序列是序列优化的编码序列，较佳地如SEQ IDNO. : 3 所示。 在另一优选例中，所述的ispA蛋白编码序列是序列优化的编码序列，较佳地如 沈QIDNO. : 6所示。 在本专利技术的第Η方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有携带外源的 第一表达盒的第一表达载体和外源的第二表达盒的第二表达载体，或者所述的宿主细胞的 基因组中整合有外源的第一表达盒和外源的第二表达盒， 其中所述第一表达盒表达pts蛋白；而所述的第二表达盒表达ispA蛋白。 在另一优选例中，所述的第一载体和第二载体是同一载体（即pts基因的多核巧 酸序列和ispA基因的多核巧酸序列位于同一载体上）。 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。 在另一优选例中，所述的真核细胞包括酵母。 在另一优选例中，所述的真核细胞是除了广蕾香（PogostemonC油lin)之外的植 物细胞。 在另一优选例中，所述的原核细胞是大肠杆菌。 在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌。 在另一优选例中，所述的宿主细胞还含有第Η表达载体，所述的第Η表达载体携 带用于表达选自下组蛋白的第Η表达盒： (a)dxs2 蛋白；[004引化）idi蛋白； (c)MVA途径的合成蛋白，较佳地选自；atoB、mvaS、mv址,mvaKl、mvaK2、mvaD、或其 组合；[00川（d)上述（a)、化）、（C)的任意组合。 在另一优选例中，所述的（C)是atoB、mvaS、mv址,mvaKl、mvaK2、mvaD六种蛋白所 构成的组合。 在另一优选例中，所述的第Η表达盒同时表达dxs2蛋白和idi蛋白。 在本专利技术的第四方面，提供了一种生产广蕾香醇的方法，包括步骤：培养本专利技术第Η方面所提供的宿主细胞，从而表达pts蛋白和ispA蛋白，并获得 含广蕾香醇的发酵产物；和 从所述发酵产物中分离和/或纯化所述的广蕾香醇。 在本专利技术的第五方面，提供了一种编码广蕾香醇合成酶的核巧酸序列，所述的核 巧酸序列编码SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，而且所述核巧酸序列的的编码区与SEQ ID NO: 3所示核巧酸序列有95% W上相同性。 在另一优选例中，该核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示。 在本专利技术的第六方面，提供了本专利技术第一方面所提供的基因组合、本专利技术第二方 面所提供的构建物、或本专利技术第Η方面所提供的宿主细胞的用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因组合，其特征在于，所述的组合包括(i)pts基因的多核苷酸序列和(ii)ispA基因的多核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，汪建峰，熊智强，李诗渊，刘巧霞，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31