本发明专利技术公开了修饰的米曲霉乳糖酶及其制备方法和应用。所述聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的结构通式为：R1-NH-R2；其中，R1为活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；R2为去除一个氨基的米曲霉乳糖酶分子。本发明专利技术进一步公开了制备所述修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括：将米曲霉乳糖酶溶液的pH值调节为酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物进行修饰反应得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。本发明专利技术方法米曲霉乳糖酶转化率高，所修饰得到的米曲霉乳糖酶酶活保持在85%以上，热稳定性和抗酸能力有显著提高，免疫抗原性有所降低，扩大了应用范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及修饰的酶及其制备方法，尤其涉及修饰的米曲霉乳糖酶及其制备方法和应用，属于米曲霉乳糖酶的修饰领域。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，健康的饮食习惯越来越受到重视，最明显的表现就是乳及乳制品的消费量迅速增加。但是亚洲人口中约有70%的人患有不同程度的“乳糖不耐症”，“乳糖不耐症”在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响，如引发钙吸收不良、腹泻、软骨病和骨质疏松等，阻碍了乳工业的发展。利用乳糖酶降解乳糖目前是解决“乳糖不耐症”的最佳处理方法。乳糖酶(Lactase)是一类催化特殊类型的糖苷键——β -半乳糖苷类化合物中 β -半乳糖苷键发生水解断裂的酶。乳糖酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1-4个半乳糖，生成低聚半乳糖。米曲霉乳糖酶是胞外酶，发酵成本低，分离提取方便，而且较耐热、耐酸，稳定性好。米曲霉乳糖酶属高温乳糖酶，最适作用温度较高，一般在50°C以上，生产中能有效地防止杂菌的污染；反应速度快，反应时间短，酶的用量少，生产效率高。乳糖酶可广泛应用于食品工业和医药工业。乳糖酶可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，可明显提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量，降低乳制品中乳糖的含量，提高乳制品的可消化性。由于乳糖的溶解度较低，在冷冻乳制品中容易结晶析出，影响产品的质量，乳糖的降解可以克服乳制品中乳糖的析出问题，从而延长产品的货架期。在发酵乳制作酸乳中添加乳糖酶，可以缩短发酵时 间，减少蔗糖用量，改善发酵乳的风味和口感。乳糖酶可以催化半乳糖基转移反应，因此可以用于低聚半乳糖的生产，低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，能够促进人体肠道内有益菌的增殖；促进矿物元素的吸收，特别是促进钙的吸收；改善脂质代谢，降低血清中胆固醇的浓度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例。乳糖酶在医药工业中可做为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻、由感冒及消化不良等引起的继发性腹泻，特别是霉菌所产的乳糖酶耐酸性较强，不被胃酸分解，能够到达小肠降解乳糖，缓解消化不良等症状。聚乙二醇(PEG)是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物，是一种安全载体，PEG通过共价键与蛋白质连接，可以与蛋白质分子中的α-氨基、ξ_氨基反应对蛋白质分子进行修饰，通过对蛋白质表面氨基进行修饰以有效地改变蛋白质的生理特性。修饰后的蛋白质具有一些特殊的性质1、PEG化可以使蛋白质稳定性、抗酸能力、抗变性能力及抗蛋白酶水解能力提高；2、PEG化可以降低蛋白质的药物抗原性，扩大应用范围；3、PEG 化对酶活性影响不太，大多数酶活性损失不大。米曲霉乳糖酶分子量在90000Da左右，最适反应温度为55°C，低温下相对稳定， 4°C保存I个月后，酶活开始下降，高温条件下稳定性较差，70°C保温2h，残留酶活力几乎完全丧失，仅存5%左右；最适反应pH值为5. 5, pH值为4. O 8. O时相对稳定。在最适条件下，米曲霉乳糖酶活力为13000U/g。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是将米曲霉乳糖酶用聚乙二醇或其衍生物进行修饰得到修饰的米曲霉乳糖酶；本专利技术的目的之二是提供一种修饰米曲霉乳糖酶的方法；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，其结构通式为=R1-NH-R2 ；其中，R1为活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；优选的，所述的活化的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇；所述的活化的聚乙二醇衍生物选自单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、 丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛或单甲氧基聚乙二醇乙醛；其中，所述的聚乙二醇是直链的聚乙二醇或是带支链的聚乙二醇，聚乙二醇的分子量为5000 20000 ；R2为去除一个氨基的米曲霉乳糖酶分子。本专利技术的另外一个目的是提供制备所述聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括以下步骤 将米曲霉乳糖酶溶液的pH值调节为弱酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物进行修饰反应，得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶；本专利技术通过实验发现，米曲霉乳糖酶溶液的pH值对于修饰反应的修饰率以及修饰后产物的相对酶活有较为明显的影响；本专利技术通过大量的试验发现，将米曲霉乳糖酶溶液的PH值调节为4. 5 7. 5时，能够有效提升修饰率，修饰后的米曲霉乳糖酶也能保持较高的酶活；本专利技术通过进一步的实验发现，当米曲霉乳糖酶溶液的pH值为5. O 6. O,尤其是5. 5时，不仅修饰率达到最高点，修饰的产物-米曲霉乳糖酶也能保持较高的酶活；为此， 本专利技术修饰反应中，米曲霉乳糖酶溶液的PH值优选为5. O 6. O,最优选为5. 5。本专利技术通过实验发现米曲霉乳糖酶溶液的浓度对修饰效果影响不大，所以在修饰反应中米曲霉乳糖酶溶液的浓度可以根据反应的情况(例如所加入活化剂的浓度等)进行调整，作为参考，本专利技术修饰反应中的米曲霉乳糖酶溶液的浓度可以为500 5000U/mL，优选为 2000U/mL。本专利技术通过大量的试验进一步发现，所加入的活化剂(活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)与米曲霉乳糖酶的摩尔比对于修饰反应的修饰率以及修饰后产物米曲霉乳糖酶的酶活有非常显著的影响；本专利技术通过大量的筛选试验发现，所加入的活化剂 (活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)与米曲霉乳糖酶的摩尔比为3 20 :1，修饰反应的产物具有较高的修饰率，产物也能保持较高的酶活；活化剂与米曲霉乳糖酶的摩尔比优选为15 20 :1，进一步优选为16 20 :1，特别优选为16 17 :1，在上述摩尔比范围内，修饰率不仅有非常显著的提升，修饰后的米曲霉乳糖酶也能保持较高的酶活，其中，当活化剂与米曲霉乳糖酶的摩尔比为16:1时，修饰后的米曲霉乳糖酶在相对酶活和修饰率之间达到了最佳平衡。所述的修饰反应的温度优选为4 37°C，优选为20 25°C，最优选为25°C。所述的修饰反应的时间优选为10 120分钟，优选为25 40分钟，最优选为30分钟。本专利技术进一步提供一种从上述修饰反应产物中分离和纯化聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括以下步骤将反应产物依次经过离子交换层析和凝胶过滤层析提纯，去除游离的聚乙二醇 (PEG)和未反应蛋白，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。所述的离子交换层析可以采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质包括聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型等，阳离子交换体积可以为6 600mL，流速可以为O. 5 50mL/min，用起始缓冲液平衡3 8倍柱体积，上液量为2 200mL，先用 I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液、起始缓冲液+0 O. 4mol/LNaCl溶液，洗脱3 15倍柱体积；所述起始缓冲液可使用磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液等，PH值在4. 5 7. 5 ;收集各组分洗脱液，采用高效液相色谱分析各组分，合并聚乙二本文档来自技高网...
【技术保护点】
聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，其特征在于，其结构通式为：R1?NH?R2；?其中，R1为活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；?R2为去除一个氨基的米曲霉乳糖酶分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵从波，陈文杰，马清河，章淑艳，李军，王云鹏，秦艳梅，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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