本发明专利技术涉及引起选择性靶向肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的方法和组合物。通过离体(ex vivo)基因治疗方案，肿瘤细胞被工程化以表达α(1,3)-半乳糖基表位。然后照射细胞或以别的方式杀死细胞并给予患者。所述α-半乳糖基表位引起肿瘤细胞的调理，增强了通过抗原呈递细胞的调理的肿瘤细胞的摄取，导致肿瘤特异性抗原呈递的增强。因此刺激动物免疫系统产生攻击和杀伤动物肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞毒性细胞和抗体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】使用表达a (1,3)-半乳糖基转移酶的同种异型肿瘤细胞 的抗肿瘤免疫 本申请是2003年10月9日提交的题为"使用表达α (1，3)_半乳糖基转移酶的同 种异型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫"的中国专利申请200380101152. 0的分案申请。 交叉参考相关申请 本申请根据35 U. S. C. § 119 (e)要求2002年10月9日申请的临时申请 60/417, 343的优先权。 专利
本专利技术涉及通过刺激体液和细胞免疫应答抗肿瘤细胞而治疗癌症的方法和组合 物。特别地，本专利技术涉及刺激补体介导的肿瘤细胞破坏和伴随刺激肿瘤特异性抗体产生和 肿瘤特异性细胞毒性细胞的方法。 专利技术背景 异种移植（xenotransplantation)的主要障碍是引起超急性异种移植排斥（HAR) 的外源组织中存在的糖类表位的立即识别。该反应在再灌注时立即开始，而且一旦启 动就会在几分钟到几小时之内破坏外源组织。在一些供体/受体（recipient)组合中 存在HAR(而在其它组合中不存在）推断与两种主要的因素相关，a)受体的异源反应性 (xenoreactive)天然抗体与移植物中抗原或内皮细胞的结合及b)移植体的补体调节蛋 白和受体的补体系统的不相容性，使得补体不受控制的激活。人血清中高于1%的补体结 合性天然抗体识别单一结构：Gala (l-3)Gal0 (l，4)GlcNAc_R。Gala (l-3)Gal0 (1，4) GlcNAc-R的合成由酶α (1，3)半乳糖基转移酶（aGT)催化。 这个酶通过如下反应催化多种非灵长类哺乳动物细胞的高尔基体中α半乳糖基 (a Gal)表位的合成： Galβ (I, 4)GlcNAc-R+UDP-Gal ^ Galα (1-3)Galβ (I, 4)GlcNAc-R 发现这个酶在新世纪猴（new world monkey)中是有活性的，而在旧世纪 猴（old world monkey)和人中没有活性。从牛和鼠 cDNA文库中克隆了 aGT cDNA。 Larson，R.D.等（1989) "Isolation of a cDNA Encoding Murine UDP galactose; β-D-galactosyl-(I, 4)-N Acetyl-D-Glucosamine a -(I, 3) Galactosyl Transferase ： Expression Cloning by Gene Transfer''，PNAS，USA 86 :8227 ;和 Joziasse，D. H.等， (1989) "Bovine a-(1，3)Galactosyl Transferase isolation and Characterization of a cDNA Clone, Identification of Homologous Sequences in Human Genomic DNA''， J. Biol Chem 264 :14290。 该基因存在于人类基因组中，尽管没有检测到转录。然而，在编码该酶的人外显子 中发现了两个移码突变（产生成熟前终止密码子的缺失）。参见Galili，Uri "Evolution in Pathophysiology of the Human Natural anti-a -Galactosyl IgG(anti-a Gal) Antibody''，Springer Semin. Immunopathol. (1993) 15 :155-171 〇 抗a Gal，是一种存在于所有人中的天然抗体，与糖类表位Gal a (1-3) Galf3 (l，4)GlcNAc-R(aGal)特异性相互作用。这个抗体不与任何其它已知的哺乳动物 细胞产生的糖类表位相互作用（Galili，1993，Springer Seminar Immunopathology 15: 153)。抗 aGal组成大约为 I % 的循环 IgG (Galili等，1984, J. Exp. Med. 160 :1519)并且也 发现是 IgA 和 IgM 的形式（Davine 等，1987, Kidney Int. 31 :1132 ;Sandrin 等，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :11391)。其由 1%的循环 B 淋巴细胞产生（Galili 等，1993，Blood 82 :2485)。人类这个天然抗a Gal Ab的产生通过存在于肠和肺菌群中的a Gal糖类残基 而持续刺激。人类中，抗a Gal在超急性异种移植排斥中与存在的这个表位反应并且补体 在几分钟到几小时中迅速及必然导致外源组织的破坏。 本专利技术的一个目的是通过将编码a GT的基因导入肿瘤细胞中发展一种治疗性癌 症疫苗，将aGal表位添加到这种疫苗肿瘤细胞中以便通过天然抗a Gal抗体增强疫苗细 胞的调理并且刺激肿瘤抗原呈递以诱导对该肿瘤特异抗原的体液和细胞免疫应答。 本专利技术的另一个目的是提供一种治疗性药物组合物，其包含表达和具有α GT以 工程化细胞a Gal表位的重组肿瘤细胞。 本专利技术的另一个目的是提供用于治疗肿瘤的组合物和方法、病毒、赘生性细胞或 其它细胞，其生长并逃避细胞和体液免疫应答。 根据如下本专利技术的说明书，本专利技术的其它目的将会变得明显。 专利技术简述 本专利技术涉及引起免疫应答的方法和组合物以选择性靶向和杀伤肿瘤细胞。通过离 体（ex vivo)基因治疗方案，肿瘤细胞被工程化以表达a Gal表位。然后细胞被杀死（通 过γ或紫外线照射、热、甲醛等）并给予患者。aGal表位引起肿瘤细胞的调理，增强了在 全肿瘤细胞中存在的抗原的肿瘤特异性抗原呈递。本专利技术的一个重要特征是应用全细胞在 本专利技术的药物组合物中。这提供了全肿瘤细胞中存在的肿瘤相关抗原的加工，而无论是否 这些蛋白受到添加 aGal表位的影响。应为aGal修饰影响了多种细胞表面糖蛋白和糖脂， 动物免疫系统将具有更多的机会检测、加工和产生对肿瘤特异性抗原的抗体和细胞免疫应 答。因此刺激了动物的免疫系统产生肿瘤特异性抗体和免疫细胞，其攻击和杀伤动物中存 在的、具有肿瘤相关抗原的a Gal阴性肿瘤细胞，所述抗原与工程化的全细胞疫苗提供的 抗原是共同的。 按照本专利技术，通过导入多核苷酸序列产生药物组合物，所述序列离体（ex vivo)编 码表达鼠 a GT给全肿瘤细胞。受体肿瘤细胞可以是同系基因、同种异型或自体的。通过 任何核苷酸转移载体将所述序列导入，所述载体可以包含病毒或非病毒载体，产生活性病 毒颗粒的质粒或载体生产细胞。这些基因转移载体转化肿瘤细胞，并引起插入其中的外源 遗传物质的表达。所得基因产物在所述细胞上存在的细胞表面糖蛋白和糖脂上催化a Gal 表位的合成。本专利技术应用了具有多种细胞表面糖蛋白的全肿瘤细胞以通过预先存在的抗 a Gal抗体最大化结合a Gal表位，因而增强这个复合物与抗原呈递细胞上存在的Fc受体 的结合，并因此引发在所述疫苗肿瘤细胞上存在的多种肿瘤相关抗原的抗原呈递。在一个 更优选的实施方案中，可以给予来自相同的组织类型或癌类型的多种类型的转化细胞，因 此进一步提高了本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备用于癌症治疗的全细胞疫苗的母细胞库的方法，包括：从选自以下的人肿瘤细胞系获取活细胞样品：A549、NCI‑H460、NCIH520、MCF‑7、BT‑20、HPAF‑II、PANC‑1、ASPC‑1、BxPC3、IGROV、ES‑2、NIH:OVCAR3、PA‑1、COLO829、G‑361、HCT‑116、COLO205、LoVo、WiDr、DLD‑1、HCT‑15、SW620、SW480、SW1116、HT‑29、FHC、CCD841CoN、PC‑3、LNCaPFGC、MDAPca2b和DU145；用编码表达α(1,3)半乳糖基转移酶的载体转化所述细胞，以便所述α(1,3)半乳糖基转移酶合成位于所述细胞上的多种细胞表面糖蛋白上的α半乳糖基表位，以产生一群细胞；用抗αGal抗体对这群细胞染色，以鉴定表达α半乳糖基表位的细胞；通过荧光激活的细胞分选从细胞群中选择5%的在其细胞表面上具有最高αGal表位表达水平的细胞，以获得细胞亚群；扩增该细胞亚群以产生用于癌症治疗的表达αGal表位的母细胞库；以及冷冻细胞。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小查尔斯·J·林克，塔季扬娜·谢瑞金娜，加芙列拉·罗西，
申请(专利权)人：衣阿华中央卫生系统，
类型：发明
国别省市：美国;US
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