利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法。先构建家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的载体pBMRJP1质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和蜂王浆主蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，自交使蜂王浆蛋白1基因纯合，育成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕。本发明专利技术借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕后部丝腺细胞特异地合成分泌蜂王浆主蛋白1，蜂王浆主蛋白1制品具有生物活性，开发了一种新型的蜂王浆主蛋白1生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，为大量生产蜂王浆主蛋白1奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用家蚕合成蛋白的方法，尤其是涉及转基因技术的一种利用家蚕 后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法。
技术介绍
蜂王浆是工蜂哺育蜂咽下腺分泌的用来饲喂蜂王幼虫和1-3龄工蜂幼虫的食物， 也是决定蜜蜂极型分化的关键物质。蜂王和工蜂具有相同的遗传背景，但是蜂王一直饲喂 蜂王浆，寿命可以达到数年之久，而且产卵高峰期的产卵量可以达到2000多粒卵/日，工蜂 寿命一般只有一个月左右。通过蜂王浆饲喂果蝇也发现，新鲜蜂王浆能延长寿命，并且促进 雌性卵巢发育，提高繁殖力。同时蜂王浆也具有延缓衰老、抗氧化、提高免疫活性、促进细胞 增殖和预防癌症等生物学活性。蜂王浆由蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、无机盐和水等多 种物质组成，其中蛋白质包括非可溶性蛋白和可溶性蛋白，可溶性蛋白占总蛋白含量的一 半以上，称为蜂王衆主蛋白（Major royal jolly proteins，MRJPs)。目前已经发现的MRJPs 主要有10种，研宄的比较清楚的是MRJP1-MRJP5，而王浆主蛋白中含量最高的是MRJP1，达 到可溶蛋白含量的48%。 研宄发现蜂王衆主蛋白1 (Major royal jolly protein 1，MRJP1)是决定蜜蜂级 型分化的关键因子，而且MRJP1具有缩短果蝇发育时间、提高雌性繁殖力和延长寿命的作 用，进一步的研宄表明，MRJP1是通过参与表皮生长因子受体（Epidermal growth factor rec印tor)代谢通路来实现以上功能的。通过对比新鲜蜂王浆和40°C存放7日已经降解 的蜂王浆的生物学特性，发现MRJP1具有促进原代培养的鼠肝细胞分裂的作用，具有促 进肝脏细胞形成和保护的作用。MRJP1和胰蛋白酶消化后的MRJP1也具有刺激巨噬细胞 释放肿瘤坏死因子a，起到抗肿瘤的作用。来源于MRJP1的肽段能够抑制血管紧张素酶 (angiotensin I-converting enzyme，ACE)活性，起到治疗高血压疾病的功能。 中华蜜蜂蜂王浆主蛋白l(AccMRJPl)基因已经测序成功，该基因全长1462bp，编 码区序列全长1302bp，可编码长433个氨基酸的糖基化蛋白，其中包含一段20个氨基酸的 信号肽序列。序列分析发现，中华蜜蜂和西方蜜蜂的cDNA之间同源性达到93. 78 %，氨基酸 序列之间同源性为90. 5%。 家蚕生物反应器具有对外源蛋白进行糖基化修饰的功能，利用家蚕后部丝腺生物 反应器大量生产蜂王浆主蛋1，为蜂王浆主蛋白1生物学功能研宄提供支持。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提出了一种利用家蚕后部丝 腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，利用转基因家蚕技术将蜂王浆主蛋白1基因导入家蚕 基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌蜂王浆主蛋白1的家蚕， 通过家蚕后部丝腺细胞分泌的蜂王浆主蛋白1可以在茧层中用磷酸盐缓冲液直接提取，为 提高蜂王浆主蛋白1的生产效率、降低生产成本奠定基础。 为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下： (1)采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒pBMRJPl， 质粒pBMRJPl包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达 框； (2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJPl质粒及能够提供piggyBac转座酶的 辅助质粒PHA3PIG质粒按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用 piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内； ⑶蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在 G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的 转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代； (4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基 因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代； (5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配， 制成G4代； (6)从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经 连续3代同样方法的选择、交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞 能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕； (7)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，并随该转基因家蚕吐丝结 茧行为进入蚕茧。 所述的质粒pBMRJPl是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因以用于 质粒的扩增和筛选，质粒pBMRJPl包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以用于 目的片段转座，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3XP3启动子 启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3XP3 Promoter-DsRed-SV40,以用作转基因阳性家 蚕的筛选标记；另一个功能表达框是包含蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因 信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、蜂王浆主蛋白1基 因（MRJP1编码基因）和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-MRJP1-Fibroin L chain SV40 PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序 列用于去除六个组氨酸标签。 所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座 臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase_SV40 PolyA 〇 所述的蜂王浆主蛋白1基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链 信号肽的作用下，分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺和前部丝腺，直到蚕茧。 本专利技术是先构建家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于该方法的步骤如下：（1）采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒pBMRJP1，质粒pBMRJP1包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达框；（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJP1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内；（3）蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代成为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；（4）G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；（5）G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；（6）从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的方式再连续3代进行选择和交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕；（7）通过该转基因家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蜂王浆主蛋白1随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，钱秋杰，叶露鹏，尤征英，车家倩，王少华，宋佳，张玉玉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33