一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法技术

一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，利用该方法可以成功解决外源基因难以导入大豆的难题。本发明专利技术以大忆豆下胚轴切段为外植体，用含有外源基因的根癌农杆菌浸染后共培养，将共培养后的外植体经过转基因愈伤组织的诱导和筛选后统计转基因愈伤组织的转化效率高达８７．７％。该转化方法的外植体制备简单、实验流程短、转化效率高。该大豆转基因愈伤组织转化体系的建立，在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立等方面有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体说是建立了一种简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组织的方法，该方法在大豆生物技术相关领域包括功能蛋 白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系 的建立等方面有广泛的应用价值。
技术介绍
:大豆(Glycine max L.)起源于我国，栽培历史悠久，是人类主要植物 性蛋白质来源之一，又是重要的家畜饲料和许多工业的原料，在医学上也有很大价值，因而 是一种非常重要的农作物。大豆的生产容易受到各种环境因素的影响，因此产量很不稳定， 常规育种技术由于受到物种杂交不亲和性以及不良基因性状连锁等因素的影响，在引入其 他物种优良基因的同时也带入了许多不良的基因，因而很难进一步利用。而利用大豆转基 因技术可以定向培育大豆优良品种，并将对大豆产量的提高和品质的改良起到重大的推动 作用。自Hinchee等(1988)和McCabe (1988)分别用两种转化方法转化大豆成功得到转基 因植株以来，虽然也相继有这方面的报告，但是大豆转化一直没有突破性的进展，具体来说 就是转化效率低、操作流程繁琐，并且实验结果的重复性差。目前应用于大豆遗传转化的方 法主要有根癌农杆菌介导法、基因枪法、真空抽滤法和花粉管导入法等，但其中获得较为广 泛应用的只有根癌农杆菌介导法和基因枪法。农杆菌介导的大豆遗传转化与其它方法比起 来具有经济、操作简单、能够准确、完整地将T-DNA以单拷贝或低拷贝的形式插入到受体基 因组中等优点，因此仍然是大豆遗传转化的首选方法。 利用农杆菌介导大豆遗传转化选用的外植体通常是分生能力较强，能够在分生区 的细胞整合外源基因到受体细胞的染色体中，如子叶节、胚尖、下胚轴、萌动的子叶等外植 体，以子叶节外植体进行转化是传统的方法，这一系统由Hinchee等利用Peking无菌苗子 叶节为外植体首次获得大豆转基因植株，之后Olhoft等报告在共培养阶段添加L-半胱氨 酸等抗氧化剂可以使转化率有显著的提高。近年来用成熟的大豆胚尖、下胚轴和萌动的子 叶做外植体进行转化也有许多成功的报告。虽然大豆的遗传转化取得了一定的进展，但是 利用这些外植体进行转化存在外植体的制备比较烦琐、转化植株中嵌合体较多、后期筛选 的工作量大等诸多问题一直制约着转化效率的提高。 植物的愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤剌激后，在伤口表面新生 的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在组织 培养中，将植物器官或组织(如芽、茎尖、根尖、下胚轴或花药)的一部分切下来，在无菌的 条件下放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成一团 没有分化的薄壁细胞，叫做愈伤组织。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个 时期启动期、分裂期和分化期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对 诱导细胞开始分裂效果很好。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生 子细胞的过程。分裂期的愈伤组织细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分 裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态 和功能的细胞。愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织 便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。愈伤组织在快繁技术、单倍体育种以及人工种子的制备等有广泛的应用价值。 随着生物技术的发展，基因工程给人类带来了许多社会和经济效益。许多研究者 通过在植物细胞中转入外源基因来调控作物的农艺生产性状，进一步达到改善作物品质和 提高产量的目的。如高越峰等(2001)将高赖氨酸蛋白基因转入水稻的愈伤组织通过再生 获得了赖氨酸含量大大提高的转基因水稻植株；Fernando et al. (2005)将crylC基因转 入玉米幼胚愈伤组织获得了抗病性强的转基因玉米；邢莉萍等(2008)将小麦类甜蛋白基 因转化小麦的愈伤组织获得了抗白粉病的转基因小麦植株。此外，通过转基因手段可以在 愈伤组织中增强某种关键酶基因的表达水平来提高有用次生代谢产物的含量，如姜楠等 (2009)通过农杆菌介导大豆子叶节细胞获得了异黄酮合成酶基因高表达的大豆转基因愈 伤组织。在功能基因的研究中，利用转基因愈伤组织可以避免叶绿素自发荧光的干扰来研 究目的基因编码蛋白的定位，如夏玉凤(2006)建立了一个可以利用烟草的转基因愈伤组 织研究目的蛋白亚细胞定位的体系。 目前，关于大豆转基因愈伤组织的转化体系的研究很少，在现有的几篇报道中都 使用大豆无菌苗子叶节作外植体，外植体的制备繁琐，转化效率低，并且在转化的外植体只 能诱导出一块独立的转基因愈伤组织。另外，以前的研究在外植体的取材上也仅仅限于国 外几个比较容易转化的大豆品种，而利用转基因愈伤组织获得具有稳定遗传转化大豆植株 的研究在国内外也属空白，因此在很大程度上制约着大豆基因工程的发展。而建立一个简 单、快速、高效地获得转基因愈伤组织的转化体系，不仅对于大豆功能蛋白的定位、启动子 活性的检测有重要的理论意义，而且对于大豆基因工程、细胞工程、代谢工程和高效大豆遗 传转化体系的建立有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的是解决现有的获得大豆转基因愈伤组织的技术体系中， 因外植体制备繁琐，转基因愈伤组织诱导效率低，外源基因难以转化大豆受体细胞以及转 基因愈伤组织的纯合困难，使得转化工作强度大，实验流程长，并且获得的转化愈伤组织难 以满足研究和应用的需求等问题，提供一种新的简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组 织的转化方法。 本专利技术通过以下技术方案实现简单、快速、高效地获得大豆转基因愈伤组织，具体 包括以下步骤 第一步外植体的制备 将成熟的大豆种子经过氯气熏蒸2. 5-5小时后转于含有0. 8-1. 5mg L—1 6-BA的无 菌水中，2『C黑暗条件下萌发10-18小时后去除种皮、子叶、原叶和胚根，剩余的下胚轴切 段作为待转化的外植体。 第二步农杆菌工程菌液的制备及浸染将含有外源基因的农杆菌LBA4404 (农杆菌LBA4404购自中国科学研究院微生物 研究所)单菌落接种于YEP液体培养基中，28t:、200rpm振荡12小时，然后以1/100的比例 扩大培养，待菌液的浓度达到0D6。。 = 0. 8时，4°C 、4000rpm离心12分钟，收集菌体并重悬于 液体浸染培养基中至0D6。。 = 0. 5，将制备好的外植体浸泡于菌液中浸染30分钟。 第三步外植体与农杆菌共培养 外植体经过农杆菌浸染后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于 表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基上，24t:黑暗条件下培养3天。 第四步转基因愈伤组织的诱导 将共培养3天的外植体切口向下转入转基因愈伤组织诱导培养基上，于25°C 、光 照强度100 Em—2s—^光周期16h光/8h暗的条件下培养10天。 第五步转基因愈伤组织的筛选及继代 待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基上，两周后 将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔 两周，便将形成的转基因愈伤组织切成2mm的小块，转入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，具体包括以下步骤：　　第一步：外植体的制备　　首先将成熟的大豆种子用氯气熏蒸消毒２．５－５小时，然后将种子浸泡于含有０．８－１．５ｍｇ　Ｌ－１６－ＢＡ的无菌水中，２８℃黑暗条件下萌发１０－１８小时之后，去除种皮、子叶、原叶和胚根，剩余的下胚轴切段作为待转化的外植体；　　第二步：农杆菌工程菌液的制备及浸染　　将含有外源基因的农杆菌ＬＢＡ４４０４单菌落接种于ＹＥＰ液体培养基中，２８℃、２００ｒｐｍ振荡培养１２小时；然后以１／１００的比例扩大培养；待菌液的浓度达到ＯＤ６００＝０．８后，４℃、４０００ｒｐｍ离心１２分钟收集菌体，并将菌体重悬于液体浸染培养基中至ＯＤ６００＝０．５，将上步制备好的外植体浸泡于菌液中浸染３０分钟；　　第三步：外植体与农杆菌共培养　　将第二步经过农杆菌浸染后的外植体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基上，２４℃黑暗培养３天；　　第四步：转基因愈伤组织的诱导　　将第三步共培养３天的外植体切口向下转于转基因愈伤组织诱导培养基上，２５℃、光照强度１００μＥｍ－２ｓ－１、１６ｈ光／８ｈ暗的光周期条件下培养１０天；　　第五步：转基因愈伤组织的筛选及继代　　待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基上，两周后将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔两周，便将形成的转基因愈伤组织切成２ｍｍ的小块，转入新鲜的转基因愈伤组织筛选培养基上继代培养一次来保持转基因愈伤组织的旺盛生长。...

【技术特征摘要】
一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，具体包括以下步骤第一步外植体的制备首先将成熟的大豆种子用氯气熏蒸消毒2.5-5小时，然后将种子浸泡于含有0.8-1.5mg L-16-BA的无菌水中，28℃黑暗条件下萌发10-18小时之后，去除种皮、子叶、原叶和胚根，剩余的下胚轴切段作为待转化的外植体；第二步农杆菌工程菌液的制备及浸染将含有外源基因的农杆菌LBA4404单菌落接种于YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养12小时；然后以1/100的比例扩大培养；待菌液的浓度达到OD600＝0.8后，4℃、4000rpm离心12分钟收集菌体，并将菌体重悬于液体浸染培养基中至OD600＝0.5，将上步制备好的外植体浸泡于菌液中浸染30分钟；第三步外植体与农杆菌共培养将第二步经过农杆菌浸染后的外植体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基上，24℃黑暗培养3天；第四步转基因愈伤组织的诱导将第三步共培养3天的外植体切口向下转于转基因愈伤组织诱导培养基上，25℃、光照强度100μEm-2s-1、16h光/8h暗的光周期条件下培养10天；第五步转基因愈伤组织的筛选及继代待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基上，两周后将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔两周，便将形成的转基因愈伤组织切成2mm的小块，转入新鲜的转基因愈伤组织筛选培养基上继代培养一次来保持转基因愈伤组织的旺盛生长。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二步农杆菌浸染外植体使用的液 体浸染培养基组分如下KN03 2 50mgL—、 CaCl2 2H20 15mgL—、 MgS04 7H20 25mgL—、 (NH4)2S04 13. 4mgL—、 NaH2P04 H20 15mgL—、 KI 0. 075mgL—、 H3B04 0. 3mgL—、 MnS04 4H201. OmgL—1， ZnS04 7H20 0. 2mgL—、 Na2Mo04 2H20 0. 025mgL—、 CoCl2 6H20 0. 0025mgL—、 CuS04 5H200. 0025mgL—、 Na2_EDTA 3. 73mgL—、 FeS04 7H20 2. 78mgL—、肌醇lOOmg...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宁宁，刘栋，常大松，石强，龚清秋，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]